荧光定量PCR基础原理精编PPT课件.ppt

退火：产生荧光信号 结合SYBR Green I SYBR Green I 染料仅在与双链 DNA（dsDNA）结合时发射荧光，所发射的光波是蓝色光。SYBR Green I 不会与单链 DNA 结合，因此变性时荧光强度最低。dsDNA形成单链（图 A）合成双链（图 B）时，SYBR Green I 结合于dsDNA上，结合的 SYBR Green I（绿色光）的荧光信号强度增强。延伸末期（图 C）时，所有 DNA 均是双链，结合状态的SYBR Green I 含量达最大，该 PCR 周期中荧光信号也达最大。因此，通常是在延伸期结束时进行 SYBR Green I 荧光信号测定。 染料法优缺点 优点 缺点 成本低 只能检测单一模板，无法多重检测 通用性好 无模板特异性，非特异性扩张和引物二聚体也产生荧光 适合初步筛查 敏感度低，不能准确测序低拷贝模板 融解曲线功能，分析非特异性扩增 荧光本底高，易引起假阳性 荧光共振能量转移（FRET） 当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)，实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。 Hybprobe探针和水解探针均基于 FRET （荧光共振能量传递）的原理设计的。 TaqMan探针法-水解探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。 TaqMan探针为一寡核苷酸，包含两个分子标记，探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被近距离的淬灭基团吸收；随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针， 其5‘－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，游离于反应体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。 TaqMan探针的数量关系 每扩增一条DNA链，就切断一条探针； 每切断一条探针，就产生一个单位荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步； 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50—150bp。 TaqMan探针的优点 特异性高 多重基因定量 荧光强度正比于产物 不可逆反应 信号生成后不会自动淬灭 Real time PCR优点 对整个PCR实时监控，明确了指数扩增期，进而可对起始模板进行定量，且定量范围广； 测定敏感性高，比电泳方法的灵敏度高2-3个数量级； 测定准确度和重复性好，Ct值和模板起始浓度有函数关系； 大大降低实验室“污染”的可能性。无需后续处理产物，可分样本处理区，加样去，检测区三区即可。 定性检测 （A或B？ 有或无？是什么？） 特定病原的检测 疾病的诊断 GMO检测 基因分型（如SNP、耐药性检测） 辨别真伪的检测 定量分析 (有多少？差几倍？） 绝对定量 病原载量的定量 GMO成分的评估 残留DNA的测定 相对定量 基因表达差异的比较 治疗手段的效果评估 实时荧光定量PCR技术的应用 ○PCR扩增的理论模式 ○Real time PCR理论基础 PCR是将样本中微量的DNA模版放大来研究模版特性。随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。 由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。 因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。 通过凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高，特异性和可靠性强，重复性好，自动化程度高、无污染性等突出优势，因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术。 PCR扩增的理论模式 PCR中，随着扩增周期的增加，模板以指数方式进行扩增。 PCR 理论方程：N = N0 × (1+E)n N: 扩增子数量 N0: 起始模板数量 E：扩增效率 n: 循环数 此公式仅在指数扩增期（20-30个循环）内成立。