分子生物学研究方法总复习刘剑老师.pptVIP

分子生物学研究方法;2.限制性核酸内切酶的命名原则 1973年，1980年进行了系统分类 ①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名;第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名。 ②第四个字母代表宿主菌的株系或型。 ③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。;限制性核酸内切酶的命名原则： 　　　属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含??多个不同的限制性核酸内切酶; 4.Ⅱ型限制性核酸内切酶的功能 　Ⅱ型限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，识别序列一般为4～8个碱基对，具有回文结构。它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。 ;;;;６.Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性 指由于反应条件改变，酶切的核酸序列不同于它特定 的识别序列,即酶切反应的特异性发生了改变。;5.2.2 　DNA分子的连接　（运用DNA连接酶进行连接）;??? 细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致遗传性状特征发生改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。;5.2.3 核酸的凝胶电泳; 在一般情况下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。;2.4. PCR(聚合酶链式反应)及其应用概念：在引物指导下由酶催化的对特定DNA序列进 行的体外扩增反应。由多个循环组成。每个循环包括了变性、退火以及延伸三个阶段。;PCR 循环 – 第一步 – 加热变性;PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火;PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸;第1个 PCR 循环完成后 –  得到两个拷贝的靶序列;①引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右 ②引物扩增跨度：以500 bp为宜，特定条件下可扩增长至 　　　　　　　　10kb的片段 ③引物碱基： ATGC最好随机分布 ④避免引物内部及引物间出现二级结构：特别是 3`端 ⑤引物 3`端的碱基要求严格配对：特别是最末及倒数第 　　　　　　　　　　　　??　　　二个碱基 ⑥引物中可以加上合适的酶切位点：要作酶切时用 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 ;;5.3 基因克隆技术;具体流程;（一）目的基因的获取; 分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。 　　　　　　　　将重点讲述 分子克隆载体的特点; 常见分子克隆载体; ;分子克隆载体总述;２、载体特点 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2.?至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3.?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞;;5.4 核酸杂交技术;5.4 核酸杂交技术; Southern Blot 操作步骤：;原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测RNA样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 ;操作过程;三　斑点杂交：;何谓SNP(单核甘酸多态性)？ 虽然同种生物其染色体差异极小,但平均1000个碱基对(base pair)就有一个发生突变,这些变异称为SNP,是造成个体的血型、身高、对药物的敏感性等差异的原因。此外,SNP也和癌症、心血管疾病、自体免疫等等疾病有关。;5.2.5 单核苷酸多态性(SNP);3. SNP的意义