亲和纯化技术.PPT

* 八、其他亲和层析 金属离子亲和层析 有机染料亲和层析 拟生物亲和层析（Biomimetic AFC） * （一）、金属螯合亲和层析 将环氧活化型Sepharose 6B与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。 金属螯合剂:亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等 . * 蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，利于蛋白质与固定化金属离子结合。 金属离子如锌和铜。 * 环氧化法 碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物； 环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。 *  甲苯磺酰氯法 甲苯磺酰氯法 在无水丙酮中进行。 优点：①活化反应迅速； ②偶联条件温和； ③偶联效率高。 * 双功能试剂法 双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团的化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、酚、醇类等偶联。 * （二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联 叠氮化法 重氮化法 (含氨基载体) 碳二亚胺缩合法（含羧基载体） * 聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法 有大量可修饰的酰胺基。 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。 * 叠氮化法 聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加1mol/L的亚硝酸，反应液搅90s； 加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。 * 重氮化法 ω-氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。 * 碳二亚胺缩合法 碳二亚胺为羧基活化剂。 反应中的脲衍生物可用有机溶剂洗涤除去。 * （三）、用于固定化配基的凝胶衍生物 1、CNBr活化的Sepharose 4B Sepharose 4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核酸类配基。 2、AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 含有6个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基。 CH-Sepharose 4B能与含有一级氨基的配基偶联。 * * 3、环氧活化型Sepharose 6B 由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体通过醚链形成的衍生物。 用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。 * 4、活化型亲和胶10和15 由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有利于碱性或中性蛋白偶联； Affi-Gel15为15个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷，故有利于酸性蛋白的偶联。 * 5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基； * 五、 影响吸附亲和力的几个因素 KL 配基浓度对亲和力的影响 空间障碍的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 微环境的影响 * （一）、配基浓度对亲和力的影响 为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值≥10。 配基浓度与亲和对解离常数相关。 对于低亲和力系统，配基浓度。 * （二）、空间障碍的影响 空间位阻。 对于分子大的配体以及小分子配基更明显。 “手臂”，增加与载体相连配基的活动度，减轻载体的立体障碍。 常用的“手臂”多为烃链。 * （三）、配基与载体的结合位点的影响 多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂具有较大的亲和力。 * （四）、载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。 （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。 * 六、 配基与间隔臂的连接 （一）、含氮配基的连接 （二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接 * 七、 亲和层析的吸附和洗脱 影响吸附的条件 亲和层析的洗脱 亲和吸附剂的再生 * （一）、影响吸附的条件 亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。 温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。 * 非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。