免疫组化技术常见问题及处理方法.PPTVIP

冰冻切片的处理 冰冻切片的组织抗原保存好 通常以5um的厚度为佳 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象 细胞涂片的处理 培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存 抗原修复 概念:应用物理或化学的方法将组织固定过程中封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复 原因：甲醛固定过程中形成醛键和羧甲基而封闭部分抗原决定簇，固定时，蛋白与蛋白之间发生交联,可能会封闭抗原决定簇 抗原修复的方法 酶消化： 如胰蛋白酶、蛋白水解酶 热抗原修复（HIER）： 水浴；微波炉；高压锅；高压消毒锅；蒸汽室 超声波 以上综合运用 修复方法从强到弱为：高压修复、微波修复、胰酶修复 热抗原修复 更有效：染色结果更一致，操作更单一 事先确定的热修复时间可适用于几乎所有的组织 一抗可以进一步稀释（节省费用） 有些抗体只有采用热抗原修复才有效 高压锅热抗原修复 比微波更有效 能处理大批量的切片 达到更高的温度 加热均匀（不像微波炉有热点和冷点）和节省时间 高压锅热抗原修复 将高压锅中的缓冲液煮开（不加盖） 将切片放入沸腾的缓冲液 盖紧盖子和高压阀，加热至全压力 达到全压力后才能计时，最佳时间由各个实验室自行确定----通常在2-4分钟 热抗原修复：注意事项 无论哪一步都不要让切片干涸（抗原可完全丢失） 加热后需要冷却15～30分钟（个别未折叠的蛋白链恢复到原来的构型） 热抗原修复存在的问题 过度的热修复会导致组织形态的破坏或组织完全消化，免疫染色变弱或定位不准确 有一个时间点，超过这个时间点进一步热修复也不会获得更强的染色效果 解决方法：采用较短时间热修复或酶消化重复实验 修复过度的实验组 修复过度的实验组 修复过度的对照组 修复过度的对照组 酶消化修复 缩短修复时间 热修复抗原会导致内源性生物素反应增强，应用卵白素抗生物素系统会产生假阳性 　　富含内源性生物素的组织： 　　 — 肝细胞 　 — 线抗体丰富的组织如肾脏、甲状腺、嗜酸细胞等 　　 — 胞浆丰富的肿瘤细胞 热抗原修复的问题：内源性生物素 组织在热修复之后，用3％的新鲜H2O2进行封闭， 以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min，再用10％鸡（鸭）蛋清阻断10～15分钟，清洗后滴加一抗 应用非生物素系统的检测试剂盒，如EnVision系统 阻断内源性生物素的方法 热抗原修复的缓冲液 pH6.0 柠檬酸缓冲液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品化修复液等 碱性 pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好 推荐使用：EDTA缓冲液 pH 8.0或Tris-EDTA缓冲液pH 9.0 是较好的常规修复液，可用于大多数热修复有效的抗体 抗体孵育条件 主要抗体浓度、温度、时间，三者一般是相互成反比的（相对） 浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度，时间决定反应的量 温度有 4 度、室温、37度，其中4 度最佳，反应最温和，背景较浅；而 37度反应速度较快，时间较短；室温不太提倡 4度过夜和从冰箱拿出后需37度复温45min 免疫组化技术常见问题及处理方法 免疫组织化学的定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术 免疫组织化学的原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光素等的二抗进行反应 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成分的分布和含量 免疫组织化学的分类 按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、荧光标记和放射性标记等 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多 按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物酶- 抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵白素- 生物素-过氧化物酶复合物（ABC ）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等 SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测 可被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测 免疫组织化学的特点 1）特异性强 2）敏感性高 3）定位准确、形态与功能相结合 Western blotting、ELISA与免疫组化的异同 Western blotting：蛋白质免疫