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酶联免疫吸附实验（ ELISA ） 免疫标记技术 放射物标记技术 酶标技术 免疫荧光技术 其他标记技术 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术 双抗体夹心法 竞 争 法 双抗原夹心法 间 接 法 双位一点法 实验目的 掌握酶联免疫吸附实验的基本原理 了解利用双抗体夹心法测定甲胎蛋白（AFP）的方法 ELISA简介 1971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA） ELISA原理 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性 结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关 ELISA原理图 ELISA基本的实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色 ELISA基本的实验过程 实验材料 AFP诊断试剂盒 AFP阳性品，阴性对照品，待检品 微量加样器 标记笔 实验步骤（示意图） 实验步骤 将包被孔编号，分别加入阳性对照、阴性对照及待测样品各100ul，37℃温育30分钟 各孔分别加入洗涤液2滴，摇匀，弃去，用蒸馏水或自来水加满各孔甩掉，反复5次，然后在吸水纸上吸干（倒扣在吸水纸上） 在各孔内加入酶结合物2滴，37℃温育15分钟 重复步骤2 各孔内加入底物1滴，随即加入显色剂1滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应2－5min，观察结果 结果判定 若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为阴性 若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性 若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性 临床意义 可以用作原发性肝癌的大规模普查 阴 性: 一般不考虑 弱阳性: 建议动态观察. 阳 性: 结合病史、临床症状及体症等综合判断 可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤 注意事项 加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成 洗涤必须彻底，防止产生假阳性 温浴的时间要严格控制 补体结合实验(CFT) 一、原理 CFT是根据任何抗原抗体复合物可激活、固定补体的特性，用一定量的补体与致敏红细胞来检测抗原、抗体间有无特异性结合的一类实验。 1、参与本实验的成分包括 ①已知抗原（或抗体） ②待检抗体（或抗原） ③SRBC ④SRBC相应的溶血素 ⑤补体 补体结合实验 2、参与本实验的五种成分分为两个系统 ①待检系统：已知抗原（或抗体）和待检 抗体（或抗原） ②指示系统： SRBC和SRBC相应溶血素 （Ag+Ab）+补体 双方不对应（或缺少一方）不形成IC 不能激活并固定补体 加入SRBC和溶血素 出现溶血 双方相对应形成IC 激活并固定补体 加入SRBC和溶血素 不出现溶血 补体结合实验 补体结合实验 二、材料 Ag：1:10稀释的伤寒杆菌 1:10稀释的痢疾杆菌 Ab: 1:10稀释的伤寒诊断血清 补体 2%SRBC 溶血素 三、操作方法 ①加样(如下图),37度水浴箱15分钟（＊标记为无） 试管号 伤寒血清 伤寒杆菌 痢疾杆菌 补体 NS 1 0.2ml 0.2ml ****** 0.2ml ****** 2 0.2ml ****** 0.2ml 0.2ml ****** 3 0.2ml ****** ****** 0.2ml 0.2ml 4 ****** 0.2ml ****** 0.2ml 0.2ml 5 ****** ****** ****** 0.2ml 0.4ml 6 ****** ******