CE-SDS检测方法.pdfVIP

附录XX 单抗纯度测定方法-CE-SDS 毛细管电泳（还原和非还原） 本法系采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳（CE-SDS）紫外检测方法，在还原和 非还原条件下，依据分子量大小，定量测定重组单抗产品的纯度。 参照毛细管电泳法（附录V G）测定。 1. 毛细管电泳系统 （1）检测器：紫外检测器，波长：214 nm。 （2）毛细管：非涂层-熔融石英毛细管（内径50μ m），切割至总长为31 cm、 有效长度为21 cm。 （3）孔塞大小: 8 (100×800 m) 2. 试剂 （1）SDS 样品缓冲液：含1% SDS 的0.1M Tris-HCl 溶液, pH 9.0。 （2）SDS 凝胶分离缓冲液：含0.2% SDS 的缓冲液（pH8.0），含有适当的亲 水性聚合物作为分子筛。 （3）0.1 N 盐酸溶液 （4）0.1 N 氢氧化钠溶液 （5）纯的2-巯基乙醇 （6）烷基化溶液：0.8 M 的碘乙酰胺水溶液, 如称取约74 mg 碘乙酰胺， 加入500µL 超纯水溶解，新鲜制备，避免光照。 （7）参比品溶液：终浓度1 mg/mL。 3. 供试品处理： （1）供试品溶液制备：用SDS 样品缓冲液将供试品稀释至1mg/mL。样品缓 冲液以相同稀释倍数稀释，为空白对照。 （2）非还原供试品溶液制备：取供试品溶液 （1mg/ml）95µL，加入0.8 M 碘乙酰胺水溶液5 µL ，涡旋混匀。取空白对照95µL，加入0.8 M 碘乙酰胺水 溶液5 µL，涡旋混匀，为非还原空白对照。 （3）还原供试品溶液制备：取供试品溶液 （1mg/ml）95µL，加入2-巯基乙 醇溶液5 µL ，涡旋混匀。取空白试剂95µL，加入2-巯基乙醇溶液5 µL ，涡 旋混匀，为还原空白对照。 将供试品溶液和空白对照在68C -7 2C 孵育，非还原供试品溶液孵育5min， 还原供试品溶液孵育15min 。冷却到室温后6,000 转/分离心1 分钟。 从样品 管中分别取出75µL 至样品瓶中，立即进行分析。 4. 样品分析 毛细管的预处理: 0.1 N氢氧化钠溶液在60 psi 压力下冲洗3 分钟，然后 用0.1 N 盐酸溶液在60 psi 压力下冲洗2 分钟，最后用纯水在70 psi 压力下 冲洗1 分钟。每次运行前应进行。 毛细管的预填充：SDS 凝胶分离缓冲液在50 psi 压力下冲洗15 分钟。每次 运行前应进行。 样品进样：10kV 反相极性电动进样。还原样品进样30 秒；非还原样品进样 40 秒。 分离：15 kV 下运行40 分钟，反相极性。 样品室温度：18C -22C 毛细管温度：18C -22C 进样顺序：参比品、样品、参比品、空白。 5. 系统适应性 （1）还原条件的系统适应性要求： 电泳图谱：参比品溶液的电泳图谱应与提供的典型电泳图谱相一致。 分离度：糖基化重链和非糖基化重链能够明显的分辨（分离度根据实际测定 数据设定）。 参比品非糖基化重链占总重链的百分比：以非糖基化重链的修正峰面积占总 重链的修正峰面积的百分比计算。参比品溶液中非糖基化重链占总重链的百分比 应在指定范围内（根据实际测定数据设定）。 迁移时间：两针参比品重链迁移时间差  1.0 分。 空白：空白溶液中应无干扰峰。 （2）非还原条件的系统适应性要求： 电泳图谱：参比品溶液的电泳图谱应与提供的典型电泳图谱相一致。 分离度： IgG 主峰与片段的分离度根据实际测定数据设定。 参比品主峰百分比：以主峰的修正峰面积占总修正峰面积的百分比计算。系 统适应性溶液主峰的相对百分含量应在指定范围内。 迁移时间：两针参比品主峰的迁移时间差  1.0 分。 注：根据仪器的不同，可调节样品进样时的条件和毛细管种类以满足系统适 应性要求。 6. 样品结果分析： 还原条件：按面积归一化法计算，以重链、非糖基化重链和轻链的修正峰面 积分别占所有修正峰面积之和的百分比分别计算重链、非糖基化重链和轻链的纯 度，三者之和即为产品纯度。[注：根据样品功能决定是否包含非糖基化重链纯 度] 非还原条件：按