单环刺螠(Urechisunicinctus)交替氧化酶对硫化物应激的适应性反应.pdfVIP

单环刺螠 （Urechis unicinctus）交替氧化酶对硫化物应激的适应性反应 单环刺螠 （Urechis unicinctus）交替氧化酶对硫化物应激的 适应性反应 摘 要 外源硫化物对有机体可产生多种危害，包括破坏机体内蛋白质及核酸的结 构、抑制线粒体呼吸链中细胞色素c 氧化酶的活性从而阻断电子传递、进一步通 过诱导氧自由基的产生和累积进而对机体产生损伤等。已知某些海洋无脊椎动物 能够通过氧化解毒这些外源硫化物，然而当外源性硫化物阻断线粒体电子传递 时，硫化物氧化产生的电子如何传递以避免氧自由基的积累产生的对细胞的损 伤，迄今在动物中尚无深入的研究报道。在植物（如烟草）中，人们发现交替氧 化酶在植物对抗逆境时发挥重要的作用，当线粒体经典电子传递途径受阻时，该 酶将通过交替氧化途径传递电子。为了探究交替氧化酶 （Alternative Oxidase ， AOX ）在海洋无脊椎动物适应硫化物中的作用，本文我们以耐硫的海洋无脊椎 底栖动物单环刺螠为研究对象，通过体外原核表达系统获得AOX 并制备多克隆 抗体；采用间接竞争性ELISA 、免疫组织化学和酶活性分析等技术揭示了单环刺 螠AOX 在4 种主要组织器官（体壁、中肠、后肠和肛门囊）中的表达特征和功 能，进一步分析了在硫化物环境中单环刺螠组织器官AOX 的适应性反应。结果 显示： 本实验构建了原核表达载体 pET28a-AOX 并成功导入大肠杆菌中获得重组 表达的AOX 包涵体。用纯化的重组AOX 免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体后， 采用免疫印迹实验在单环刺螠组织总蛋白和线粒体中检测到明显的 AOX ，在体 内该蛋白的分子量约40 kDa 。 免疫组织化学技术检测单环刺螠各组织AOX 的细胞学定位结果显示：AOX 主要在各器官的上皮组织中表达。间接竞争性ELISA 检测，单环刺螠AOX 在体 壁、中肠、后肠和肛门囊中均有表达，以后肠中含量最高，但 4 种组织之间的 AOX 含量没有显著性差异；酶活性检测发现，后肠中AOX 的酶活性显著高于其 他3 个组织 （p< 0.05 ）。 I 万方数据 单环刺螠 （Urechis unicinctus）交替氧化酶对硫化物应激的适应性反应 当单环刺螠暴露在硫化物 （50 μmol·L-1 和150 μmol·L-1 ）环境中时，其各组 织器官AOX 的蛋白含量和酶活性水平均随着硫化物浓度的提高和暴露时间的延 长而提高。150 μmol·L-1 硫化物处理组的单环刺螠各器官AOX 蛋白含量和酶活 性绝大多数高于相同处理时间下的 50 μmol·L- 1 组。结合已报道的单环刺螠硫化 物应激下细胞色素c 氧化酶活性的变化，本文进一步讨论了单环刺螠AOX 在不 同浓度硫化物暴露下的作用，提出AOX 可能作为单环刺螠硫化物应激下的第二 个电子传递者，在螠虫甚至海洋无脊椎动物适应逆境时发挥重要的作用。 关键词：单环刺螠；硫化物；交替氧化酶；交替氧化途径；线粒体电子传递链 II 万方数据 单环刺螠 （Urechis unicinctus）交替氧化酶对硫化物应激的适应性反应 Response of alternative oxidase in Urechis unicinctus to sulf