Transwell实验步骤.docVIP

Transwell实验步骤 1将小室放入培养板中，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。2 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。3 取细胞悬液200 μl加入Transwell小室。4 24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。? 5 培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 6 固定细胞：用枪头吸弃小室培养液，用PBS缓冲液洗细胞2次,枪头吸尽残余的液体，加入4%多聚甲醛（上室200ul，下室500ul）固定30分钟, 7 染色：弃固定液,PBS洗2次，晾干几分钟加入结晶紫染液,染色20分钟,弃染色液,用PBS冲洗2次，晾干，倒置显微镜下计数。