乙酰辅酶a羧化酶(acetylcoacarboxylaseacc)试剂盒使用说明.pdfVIP

乙酰辅酶A 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)试剂盒使用说明 分光光度法 货号：BC0410 规格：50 管/24 样 产品内容： 提取液：60mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：20mL×1 瓶， 4℃保存； 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存； 试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。 试剂五：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。 试剂六：液体 25mL×1 瓶，室温保存。 试剂七：10μmol/mL 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。 产品说明： ACC在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的 关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。 ACC 能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3 和ATP 生成丙二酰辅酶A、ATP 和无机磷，通过钼酸铵定 磷法测定无机磷的增加量来测定ACC 活性。 需自备的仪器和用品： 分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。 操作步骤： 一、 样本的前处理 1、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞 数量 （10 个）：提取液体积 （mL）为500~1000：1 的比例 （建议500 万细菌或细胞加4 入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞 （冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s， 重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组 织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 二、 测定步骤 1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。 2、酶促反应试剂的配制和预热：在试剂二瓶中加入6.5mL 试剂一，充分溶解混匀；在 试剂三瓶中加入5mL 蒸馏水，充分溶解混匀；将试剂一、二、三在37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热10 分钟。 3、定磷试剂的配制：按H2O: 试剂四:试剂五:试剂六 2:1:1:1 的比例配制，配好的定 磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。 注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。 4、0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七20 倍稀释，即取 0.5mL 试剂七加9.5 蒸 馏水，充分混匀。 5、酶促反应 试剂名称 （μL） 对照管 测定管 试剂一 450 试剂二 250 试剂三 200 样本 50 50 37℃ （哺乳动物）或25℃ （其它物种）准确反应30min 后，90℃水浴5min （盖紧，以防止水 分散失），冷却后，10000g 常温离心5min，取上清。 6、定磷 标准管 空白管 对照管 测定管 0.5μmol/mL 标准磷应用液 100 蒸馏水