细胞培养细节.pptVIP

清洗 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗 器皿的清消 清洁液的配制 清洁液配方 重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 63∶1000∶200 次强清洗液 120∶ 200∶1000 弱清洁液 100∶ 100∶1000 配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发。配成后清洁液一般为棕红色。 水 水的制备：? 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水  细胞培养基 市场上可提供干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、M199、F10等 细胞培养基应用选择 选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： (1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如淋巴细胞多选 RPMI1640 。 (4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 配制举例：制备1000mlRPMI?1640培养基 RPMI?1640?干粉培养基10.4g（1包）， 丙酮酸钠 0.11g, 碳酸氢钠 2g， b-巯基乙醇 3.7mm(淋巴细胞培养需要）， HEPES 5.925g（可以不加）, 蒸馏水?800ml 　　　↓　 搅拌至完全溶解，调PH = 7.2 　　　↓　 加三蒸馏水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22μm孔径滤膜的过滤器除菌，4℃保存备用 血清 种类：胎牛、新生牛、小牛、马、人血清 热灭活：56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。 血清中的沉淀物 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清 平衡盐液体 组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 用于洗涤组织、细胞等 可以过滤除菌，也可高压灭菌 PBS（Phosphate-Buffered Sallines） D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) 消化液 分离组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液 单独或混合使用 过滤除菌 胰蛋白酶溶液 主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用 称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%） 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右 谷氨酰胺补充液 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内 使用终浓度为1-4mmol/L 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制方法为 ： 谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌，分