第三讲技术方法一.ppt

氰戊菊酯处理土壤样品的PCR－DGGE图谱分析 2. PCR-SSCP（PCR-restriction fragment length polymorphisms）方法 PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的 当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变 空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同 因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开 方法原理 DNA片段长度应使用的丙烯酰胺浓度 DNA片段长度（核苷酸数） 丙烯酰胺（%） 1kb～700b 3.5 700b～500b 5 500b～200b 8 200b 12 DNA链大小 DNA链的自身结构 温度 电压 影响DNA迁移率的因素： 注意事项 核酸片段的大小:? 核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于200bp的片段，可发现70％变异；300bp能发现50％的变异；＞500bp的片段，仅能检出10％～30％的变异（150bp左右较好） 电泳温度: 保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素。 凝胶的浓度、厚度及长度