lecture01-DNA重组的四要素.pptVIP

细菌人工染色体 (BAC) engineered versions of F plasmids； capable of carrying approximately 200 kb of inserted DNA sequence； one copy per cell (oriS)； The DNA inserted stable;less prone to rearrangements and deletions ; Human artificial chromosomes (HAC) 设计思路与YAC一致：CEN、TEL、ARS，但是更复杂； 迄今仍不成熟； 可能会成为基因治疗的载体； 13 DNA重组中的基因与受体细胞 以表达基因产物为目的的重组技术的外源基因可以来自于基因组DNA(原核、真核)，也可以来自于mRNA的反转录产物（cDNA）; 如果是在原核细胞中真核基因，则必须用基因的cDNA序列； 如果是在真核细胞中表达真核基因，有人认为选用基因组DNA序列为好，但多数实例选用的是cDNA序列； 外源基因的获得 外源基因的来源非常多：文库筛选、PCR扩增的、差别显示得到，等等； 在某些情况下，必须人工合成基因（有机化学法）：优化密码子； 方法举例1：分段合成、粘端连接法（烦琐） 方法举例2：分段合成结合PCR法（巧妙，避免连接反应） 360bp 两个PCR体系，一体系加F3 , R4;另一加F4 ,R3 ,经94 ℃变性5 min 后, 10 min内缓慢降温至55 ℃, 之后迅速向两体系中各加pfu Taq DNA 聚合酶,55 ℃保温5 min ,72 ℃延伸5 min , 产物经电泳、回收（S1 和S2） ； PCR体系,加入引物F2 ,R2, S1 , S2,dNTP等 ,经94 ℃变性4 min 进入循环，循环温度及时间为94 ℃, 30 s ; 55 ℃, 30 s ; 72 ℃,30 s,共30 个循环,然后72 ℃延伸2 min ,经电泳、回收DNA 片段（S3） ； 在体系中加引物F1和R1, PCR 产物S3 等 ,反应条件同第二步,经电泳、回收360bp 的DNA 片段，得到人工合成的目的基因。 步骤说明 选择受体细胞的一般原则 易于接纳外源DNA； 无特异的内源核酸内切酶； 载体复制、扩增不受阻； 与载体的互补性。 根据不同的需求，还应考虑： 载体选择性标记与受体细胞基因型是否匹配； 遗传稳定性高，易于进行扩大培养； 内源蛋白水解酶基因确失或蛋白酶含量低，利于外源基因蛋白表达产物在细胞内积累； 可使外源基因高效分泌表达； 对动物细胞而言，所选用的受体细胞对培养的适应性强；如：可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养； 受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性； 无致病性； 具有好的翻译后加工机制等。 选择大肠杆菌宿主的基因型有何意义 为适应于分子生物学实验要求，人们已经建立了许多种不同基因型的菌株； 终止密码回复，重组机能缺失，对插入DNA具有直接作用因子的缺失，抗药性的变异，宿主蛋白酶缺失，有利于选择转化体的基因，有利于点突变的基因，菌株筛选用基因； 应根据实验目的，选择合适的菌株； 例子 例如，当用含有T7 噬菌体启动子的载体表达外源基因时，由于T7启动子只能被T7 RNA聚合酶所识别，所以必须使用能产生T7 RNA聚合酶的受体菌，如：BL21（DE3）、JM109（DE3）。 对于一些缺失β-D-半乳糖酶氨基端编码序列的受体菌（lacZ△M15），则适合用带α肽编码基因的质粒（如：pUC），以便实现互补，进行蓝白斑筛选。 部分标记符号及意义 For more information，visit “/wiki/E._coli_genotypes” E. Coli基因型的表示 小结 Thanks. * * * * * * * * 电泳缓冲液 通常用 Tris-acetate (TAE) 和 Tris -borate (TBE), pH7.5-8.0； TAE 缓冲能力较小； TBE 分离效果均匀,并且不需要两个电极室中缓冲液的混匀。 凝胶成像系统得到的灰度照片 脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 琼脂糖凝胶对分子量 50 kb 的DNA分子不再具有分子筛效应，因为这些DNA分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了； 如果周期性改变电场来进行电泳，可以使分离的上限达到10Mb，这种电泳被称为PFGE； 标准PFGE中,两个电场与核酸移动方向成相反方向的45o夹角； 基因组文库构建、核型分析等需要； 脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE) 与PFGE分离有关的几个参数 D