外周血单核细胞的分离以及培养.docxVIP

一、牛外周血单核细胞的分离 1、采血袋采集 200ml 血液 2、首先在 15ml 离心管加 3ml 分离液（室温） 3、轻轻的将 3ml 全血加到 3ml 分离液中 4、400g 室温离心 30min 5、离心后，吸取白膜层（ 0.5cm）转移到新的离心管 6、加 10ml 的 PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打） 7、250g 室温离心 10min 8、加 5ml 的 PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打） 9、250g 室温离心 10min 10、重复 8、9，加 0.5ml 培养液悬浮， 二、磁珠分选 11、 将分离得到的 PBMCs 进行细胞计数。 12、 离心细胞悬液， 300×g，10 分钟。吸去上清。 13、 将细胞沉淀用 buffer（含 0.5％BSA 的 PBS）悬浮，按每 107 个细胞加 80 L buffer 和 20μ L 抗 CD14 磁珠，充分混匀， 2-8℃孵育 15 分钟。 14、300×g，10 分钟。吸去上清。用 500μ L buffer 重悬细胞。 15、将柱子放在磁珠分离器上，吸取细胞悬液加到柱子中，用  500μ L buffer  清 洗三遍柱子。 16、 待清洗三遍后，将柱子从磁珠分选器上取下来，加入 1mL buffer ，用助推 器快速推动柱子中的洗脱 buffer ，收集单核细胞，计数。 17、单核细胞 300× g 离心， 10 分钟，用含 10％的胎牛血清、 100U/mL 青链 霉素、 PH7.2-7.4 的 1640（IMDM） 全培养液调整细胞浓度为按 1× 106 单核细 胞铺入 10cm 培养皿， 37℃5%CO2 温箱中培养。 三、磁珠分选注意事项 1、柱容量 ： 1× 107 磁性标记细胞可上达  2× 108 细胞总量。 注意：当分选的细胞比淋巴细胞大时 ，柱容量需减少。 2、建议白细胞样本大小：在 106—2×108 细胞总量中有 104—107 标记细胞 3、典型富集率：50fold 至 1000fold,取决于磁性标记的活力和特性， 达到 10000fold 富集量就可以分装两柱。 4、柱流动停止，不要干涸 5、Void 容积 :60ul.贮液器容积 3.5ml 6、PBS典型的流量包含 0.5%BSA：0.35-0.5ml/min 。 7、MS 柱不可重复使用。 MS 柱的准备： 1、准备用 buffer 漂洗的 MS 柱：取 500ul degassde buffer 到柱的上部，并使 buffer 流过全柱。 MS 柱流动停止，不要干涸。 2、弃掉废液更换收集管。此时的 MS 柱可用于磁珠分选。 注意：装满之后快速使用，避免温度升高产生气泡。用 buffer 装满柱的时间取决于贮存环境，温度和湿度。因此，时间可能从几秒到变到几分钟。这个时间并不影响分选质量。 MS 柱进行磁珠分选： 在进行下一步之前要等到柱子的贮液器是空的。 1、在 500ul 的 degassed buffer中重悬上达 108 的细胞总量。 注意：细胞数目增加，按比例增加 buffer 体积。当新鲜抗凝血剂的血液或白膜层一起作用时，分选之前用 buffer 稀释为 1：2。除去团块使细胞通过预分选过滤器。 2、将分选的细胞放至准备好的 MS 柱上，收集流动的未被标记的细胞。 3、用 3×500ul 的 degassed buffer 清洗 MS 柱。收集未标记的细胞使其与步骤  2 获得的结合。 注意：执行清洗步骤，柱子储液器一旦空了就要添加 buffer 4、从分选器上取下 MS 柱，更换新的收集管 5、吸取 1ml buffer 至 MS 柱，快速驱赶片段伴有磁性标记细胞 ....（不懂） 6、为增加磁性标记细胞的纯度，经过第二个 MS 柱洗提片段可以增加其纯度。 用一个新的柱子重复磁珠分选流程步骤 2-5。