质粒的提取与纯化.pptVIP

实验一 质粒的提取(碱法) 实验目的 了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法。 实验原理 质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 T-载体 在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。 实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器 （二） 材料 含pBC KS质粒的大肠杆菌 DH 5α。 含重组质粒的大肠杆菌 DH 5α。 （三） 试剂 1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。 2. SolutionⅠ 　50 mmol/L 葡萄糖 　 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0) 　 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 3. SolutionⅡ(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH 　 1% SDS 6. 胰RNA酶 将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 7. 氯仿，乙醇 ，70%乙醇。 实验步骤 质粒的提取 1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37℃振荡培养过夜。 2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200μL SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮。 3. 加入300μL SolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3 ℃放置5min。 4. 加入300μL SolutionIII,混匀（注意动作轻） ，冰箱3 ℃放置5min。 5. 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积（约600 μL ） 。 6. 加入等体积氯仿（约600 μL ），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4℃，离心10min，取上清液。 7. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20℃沉淀 20~30 min。 8. 12,000 rpm离心15 min。 9. 去上清，沉淀加入500μL 70%乙醇洗涤2次（ 12,000 rpm离心3分钟）。 10. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。 11. 每管中加入25μL无菌水1μL RNase， 37℃溶解质粒DNA。 Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用） ? 操作过程 1. 将1～1.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中。 2. 于10，000rpm离心30 秒，并弃去上清液。 如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。 3. 加250μl Resuspension Buffer，重悬细菌体沉淀。 重悬后应该没有细菌团块。 4. 加250μl 细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒4～6 次。 不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。 5. 加350μl Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管4～6 次。 溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。 6. 于13,000rpm离心10 分钟。 如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。 7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体。 8. 向Spin column 内加650μl Wash