多靶点pCRISPR载体（单子叶植物用）使用方法2014-05-19.docxVIP

PAGE 1 CRISPR/Cas9-based genome editing technology A pYLCRISPR/Cas9-MTmono vector system for targeting multiple gene sites of monocot plants 华南农业大学 生命科学学院 刘耀光实验室 (未公开资料) （ygliu@scau.edu.cn） 1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图 2 相关载体图谱 2.1 CRISPR/gRNA vectors (单子叶植物用)： 2.2 pYLCRISPR/Cas9-MTmono 双元载体(原命名pYLCRISPR/Cas9-MT(I) ) (用于单子叶植物) 3. 基因组靶位点选择和双链接头设计 3.1 靶位点选择 （1）在目标区如果能够找到NGG上游第20碱基是A（用U3启动子）或G (用U6a~c启动子）的序列 (A，G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基），优先选为靶序列 合成接头的形式（左：连接U3启动子；右：连接U6a启动子） 注意：接头正向引物F,反向引物R命名是根据靶点在gRNA表达盒的连接方向决定，不是基因方向决定，否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向） （2） 如果在NGG上游第20碱基不是A或G，可选20碱基为靶序列（参考Kabin Xie and Yinong Yang， 2013， Molecular Plant)合成接头的形式 （连接U6a启动子） 也就是说，所用启动子的转录起始点与NGG上游第20碱基相同靶点就是19碱基(20-1),不相同靶点就是20碱基。 （3）为了提高突变效率，可以对一个目的基因设计2个靶点(尤其只有一个靶基因)。建议在ORF 5’区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。 几个靶位点设计例： 左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF上游，或在特定的功能域 (可能引起密码子缺失和移码) 右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切） （4）靶点特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一产生有负面作用的非特异打靶，把突变体与原受体亲本杂交（回交）就可分离排除非特异打靶位点），但应该将候选靶序列+NGG（上下游加几十碱基）对目标基因组做Blast，避免在靶序列3’端+NGG与其它功能基因和基因组序列有高相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。 3.2 靶位点接头引物设计例 4. 多靶点pYLCRISPR/Cas9-MTmono载体构建 4.1 gRNA表达盒构建示意图（三靶点为例） 注： B1’ and BL 末端分别与 pYLCRISPR/Cas9-MTmono的 B1和 BL’ 末端互补。 4.2 靶点引物接头与gRNA表达盒的连接方式和扩增 为了提高接头连接效率，使用较高浓度（0.1-0.2 ?M）的靶点接头产生线性连接，而环状连接较少。但2种方式在随后的PCR中，都是通过接头正向和负链序列配对延伸而产生完整的目标片段 4.3 gRNA表达盒扩增引物 第一轮PCR扩增引物（所有gRNA表达盒共用）： U-F: 5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3; gRNA-R: 5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3 第二轮PCR扩增引物（特定位置gRNA表达盒专用）： （B1’, B2, B2’, B3, B3’等表示各连接点位置； ctcg, tcag等表示Bsa I 切点粘性末端的正链序列;相同颜色的BsaI切点粘性末端是可特异配对连接的互补末端） 靶点1（T1）： Uctcg-B1’: TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 （U3/6上游引物） gRctga-B2: AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 （gRNA下游引物） T2: Uctga-B2’: TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRaaga-B3: AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T3: Uaaga-B3’: TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRgact-B4: AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T4: Ugact-B4’: TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRggac