拟南芥原生质体转化系统.docVIP

拟南芥原生质体遗传转化 目的 了解在拟南芥悬浮培养的细胞中瞬间表达目的基因的遗传转化方法。 学习和掌握拟南芥原生质体的制备方法。 原理 原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。由于消除了细胞壁的障碍，故原生质体是遗传操作、基因转化的好材料。以植物原生质体为材料进行遗传转化，可以瞬间表达外源基因，也可以获得外源基因稳定表达的转基因细胞系或转基因植株。常用的进行原生质体遗传转化的方法有电击法和PEG介导的转化法。电击法利用高压电脉冲使细胞膜发生瞬间的可逆穿孔，从而使外源基因穿过细胞膜而进入细胞中。这种方法操作简单，转化效率高，但是需要电击仪。PEG（聚乙二醇）介导的转化方法是通过PEG处理改变细胞膜的通透性，从而使外源DNA易于进入原生质体。此方法不需要特殊的仪器设备，实验结果比较稳定。 拟南芥原生质体可以从悬浮培养的细胞分离，也可以由新鲜叶片分离制备。本实验是从拟南芥悬浮培养的细胞分离原生质体，然后进行遗传转化。 材料、试剂和仪器 3.1 材料 拟南芥（Col-0）悬浮培养细胞 带GFP报告基因的质粒 3.2 试剂 B5-0.28 M S(蔗糖)： MS盐（Duchefa M0222.0025） 4.4 蔗糖 0.28 M（96 g/l） 用KOH调pH至5.5，抽滤灭菌。 B5-0.34 M GM（葡萄糖, 甘露醇 MS盐（Duchefa M0222.0025） 4.4 g/l 葡萄糖 30.5 g/l 甘露醇 30.5 g/l 用KOH调pH至5.5，抽滤灭菌。 酶解液： 纤维素酶 1% ( 离析酶 0.2% (0.1 g/ 50 ml)以上两种酶溶于B5-0.34 M GM PEG溶液： PEG 6000 25% 甘露醇 0.45 Ca(NO3)2 用KOH调pH至9.0，抽滤灭菌。 0.275 M Ca(NO3)2： Ca(NO3)2·4H2O 64.94 g/l 抽滤灭菌。 3.3 仪器用品 50 ml锥形瓶、离心机、摇床、尖底离心管（50 ml）、圆底离心管（13 ml）、13 cm培养皿、抽滤灭菌器、高压灭菌锅、显微镜、细胞计数板、荧光显微镜、微量移液器 （1000 μl, 200 μl, 10 μl）及吸头（1000 μl, 200 μl, 10 μl）、移液管（10 ml、25 ml）、洗耳球等。 操作 4.1 原生质体的制备 操作步骤如下图所示。 注意：（1）配制溶液时要仔细称量，调pH值和定容，防止出错引起原生质体的破裂。 （2）酶溶液最好现配现用，配制好的酶解液在4℃最多 （3）酶解细胞壁的最适温度为28℃，期间需要缓慢摇动（75 rpm） （4）操作时动作要轻柔，防止原生质体的破裂。 （5）制备过程中，要先后用到两种不同培养基，注意不要用错。 （6）注意无菌操作。 1500 rpm, 1500 rpm, 5 min 弃上清，得细胞倒入无菌的50 ml 尖底离心管中继代培养2-5 d的拟南芥悬浮细胞 弃上清，得细胞 倒入无菌的50 ml 尖底离心管中 继代培养2-5 d的拟南芥悬浮细胞 拟南芥悬浮培养细胞，每周继代一次 加入25 ml酶解液 加入25 ml酶解液，25 ml B5-0.34M GM，重悬沉淀 重悬液转入2个无菌培养皿中，各加入25 ml B5-0.34M GM 每隔一小时检测一次细胞壁降解的情况 每隔一小时检测一次细胞壁降解的情况 28? 28?C，75 r/min 1500 1500 rpm, 5 min 转移到2个无菌的50 ml 尖底离心管中 转移到2个无菌的50 ml 尖底离心管中 弃上清，得沉淀约3-4h后绝大部分细胞的细胞壁已被降解 弃上清，得沉淀 约3-4h后绝大部分细胞的细胞壁已被降解 1000 rpm