刺梨离体培养 遗传多样性分析及RGA克隆的分析.docx

摘 摘 要 刺梨(Rosa roxburgflii Tratz)属蔷薇科蔷薇属植物。其果实肉脆、甜酸、具浓 郁的特殊香味，被誉为水果中的“Vc之王”：其防癌、抑癌和抗衰老等保健作用在国 内外引起很大关注。但有关刺梨生物技术方面的研究几乎为空白，本研究在刺梨的离体 培养、遗传多样性以及抗病基因类似物(RGA)的克隆等领域开展了工作，以期为遗传 改良和资源的开发利用提供理论指导和构筑技术平台，取得了以下结果： l建立起刺梨几种外植体离体培养技术 建立和优化了刺梨稳定而高效的试管苗培育体系：选用30-45 d枝龄的茎段，接种 在1／2MS(大量元素减半)+GA(1．0 mg／L)+BA(0．5 mg／L)+NAA(0．1 mg／L)+蔗糖(2．0％) +活性炭(400-500 mg／L)+琼脂(0，7％)培养基上；萌发后将萌芽转入改MS．(NH。NO。 减半)+GA(1．0 mg／L)+BA(0．5-l_0 mg／L)+NAA(0．1 mg／L)+蔗糖(3．0％)+琼脂(0．7％) 培养基上，促进材料增殖；生根培养以4—5 cm高的试管苗在1／2Ms十BA(O．3 mg／L)+NAA (0．3 mg／L)+PP∽(0．5-0．7 mg／L)+琼脂(0．7％)+葡萄糖(2．O％)或蔗糖(2．O％)+ 活性炭(300—400 mg／L)上效果最佳：生根处理20一25 d可产生5-8条1—2 cm长的乳 白色新根，炼苗10一15 d即可植入土中。获得了贵农5号和白花刺梨试管无性系，用于 离体保存和快繁。首次以下胚轴为试材建立起完善的再生体系。 基因型、外植体类型、基本培养基及添加激素等对愈伤组织的发生能力、质量有很 大影响；活性炭对褐化有很强的抑制作用；就愈伤的保存来看，以lO。C最好，至少可保 存90 d：刺梨愈伤属再分化困难植物。 首次建立和优化了刺梨幼胚培养技术体系：将子叶形期的幼胚，先接种到I／2MS+IAA (0．5 mg／L)+BA(1．0 mg／L)+LH(500 mg／L)+PVP(2．O％)+蔗糖(2．O％)上暗培养约15 d， 然后转入MS．+IAA(0．5mg／L)+BA(1．0mg／L)+GA(1．0mg／L)+LH(500mg／L)+PVP(2。O％)十 蔗糖(3．O％)光培养，可直接诱导幼胚萌发成苗。 2组培材料遗传稳定性检测 采用124个随机引物、54对特异引物对贵农5号和白花刺梨不同继代数的试管苗及 愈伤组织DNA进行检测．结果表明，在所用引物的检测范围内，2基因型试管苗在25 代以内，DNA分子上没有发现变异：而愈伤组织在15代时，DNA分子上已检测到变异， 贵农5号变异带为0．08％(RAPD)和0．06％(AFLP)，白花刺梨为0．13％(AFLP)；刺梨愈 伤组织染色体数日变异现象较为普遍，继代20代时非整倍体占观察细胞数的20．8％。 3刺梨不同基因型对白粉病的抗性鉴定 在武汉气候条件下，发病高峰期的病情指数、病害持续时间及AUDPC分析均显示， 无籽刺梨对白粉病免疫，贵农6号高抗，而贵农5号最感病。 4刺梨及其近缘种的形态学、RAPD和AFLP分析 采用36个形态学性状分析表明，8个刺梨基因型和7个近缘种可聚为6类；普通刺 桑孛簸重瓣蒯梨戮努魏墓盈登为燕l粪，重瓣裁黎弦戏第2粪，无籽裁祭弱赛强缫黧瓷 桑孛簸重瓣蒯梨戮努魏墓盈登为燕l粪，重瓣裁黎弦戏第2粪，无籽裁祭弱赛强缫黧瓷 组成燕3类：以筛选舞匏29个隧辘零l物扩增靛RAPD橡记。霹将供试样龋聚为6类，其 中普遇刺梨7个基因型单独为～獭，无籽刺梨和贵州缀丝花聚为另～类；采用54对引 物扩增的AFLP标记，供试样晶可浆为4类，箕中营灞刺黎?个基因篷为第1类，秃籽 刘梨釉贵州缫煞花为第2类，在瓣邋剡梨类巾重瓣粼裂可独成一亚豢。3麓标记系统的 系暴爨毒攫大弼一瞧，毽髓筠躐鬻秘AFLP鬟囊窝豹糕关瞧嚣大。撼据3簇标记系绞翁 分辑臻采，缝会对蕊耪母鳃藤减数分裂懿蕊察，笔嚣瓣出了溅籽剿蘩来源予爨鲻缫黧芯 雄往不蠢的骰说。 5刺粼不同肉然分布送遗传黪样性的RAPD评价 蔽多态懿爨静静16令}{镌，怼泉叁4螽豹30个辩生群艇送行￡A瀚扩壤，共产生 94蘩400-2500bp繁，其中83条显冢多态挂；来自爨蚓麴样晶蕴藏有最事害豹遗传多样 茬，褥寒囊鄂霹嵩海菠逮区斡3个襻鑫其有较毫匏遗悸蓑署莰。 6刺梨不同蕊黼型DNA指纹翮谱的梅建 嚣次采粼RAPD移AFLP撼记枣鼋建了现存豢毽型憨DNA攒纹。戳OPB-1j、OPW--02耪 OPAF一16等3个随机引物扩增的RAPD标记，可将8个刺梨基因型有效地龄别开来：筛选 篷l《对将再葶；耨，每薅霹扩蘩穗25ql条潺骥、稳定拣好鼹是憨P蒸落，箕巾EAOI艘蠡《、 EAOI／鼙C05、叛01／me06、E02／MCO；