第6章蛋白质的分离纯化专题课件.ppt

亲和层析的方法简便、迅速、高效、操作步骤少、活性不易丧失，是分离纯化蛋白质、酶、激素与重组蛋白最有潜力的技术。缺点是要分离一种物质必须找到适宜配基，并将其制成固相载体后方可进行这种层析。该法成功的另一关键是防止配基的脱落，通常选用的配基以亲和力适中，且特异性较强。 电泳技术electrophoretic technique  所谓电泳，即带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极(Electrode)移动的现象。目前所采用的电泳方法，大致可分为三类：显微电泳、自由界面电泳及区带电泳。以区带电泳应用最广。区带电泳(Zone electrophoresis)是样品物质在一隋性支持物上进行电泳的过程，因电泳后样品的不同组分可形成带状区间。采用不同类型的支持物进行该电泳时，能分离鉴定小分子物质(如氨基酸、肽类和核苷酸等)和大分子物质(如蛋白质、核酸以及病毒颗粒等)。 电泳的方式方法虽有所不同，但基本原理是相同的。颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的性质。移动速度主要决定于本身所带的净电荷量、颗粒的大小和形状。此外，还受到电场强度、溶液pH、离子强度、支持物的特性及电渗(Electronosmosis)等外界条件的影响。带电颗粒在单位电场中泳动的速度称为泳动率(Migration rate,m)或迁移率。 醋酸纤维薄膜电泳 cellulose acetate membrane electrophoresis 有电渗小、分离速度快、样品用量少、分离清晰、对样品无拖尾和无吸附现象等优点，并且染色后可透明，更便于保存和定量分析。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、同工酶、胎儿甲种球蛋白、体液和核酸等方面的检测，并已成为医学和临床检验的常规技术 。 2.琼脂和琼脂糖凝胶电泳 Agarose Gel Electrophoresis 琼脂糖很容易制成各种形状的凝胶，容易掌握，容易保存，凝胶的均一性好、牢固、富有弹性，容易固定和干燥，还可制成清晰的干膜长期保存。琼脂或琼脂糖凝胶电泳(Agar or Agarose gel electrophoresis)因胶的网孔大，液体多，近似于自由电泳，具有电泳速度快、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 acrylamide gel electrophoresis 是以人工合成的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(ACr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。聚合时所用的催化剂可以是化学聚合催化剂过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED，加速剂)，也可以是光聚合催化剂核黄素和TEMED。凝胶的机械强度、弹性、网孔的大小主要取决于Acr和Bis的比例，胶的总浓度及聚合条件。 PAGE可按凝胶的形状分为盘状和垂直板电泳。又按凝胶中pH、缓冲液组成、凝胶孔径和电压梯度是否一致分为连续电泳和不连续电泳两种。不连续电泳具有较高的分辨力，这是因为在分离过程中，除了具有一般电泳的电荷效应外，还有浓缩效应和分筛效应。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE） 十二烷基硫酸钠(Sodium decyl sulfate,SDS)是一种阴离子去污剂，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS蛋白质复合物（compound）。此复合物可用具有SDS的PAGE进行分离，通常把这种电泳称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)。 SDSPAGE则是根据各种蛋白质分子量的不同进行分离的。电泳前，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇进行热变性，巯基乙醇即使蛋白质分子中的二硫键还原，SDS破坏蛋白质亚基间的非共价键，使含有亚基(Subunit)的蛋白质解离成各个亚基。由于SDS带有较强的负电荷，使SDS蛋白质复合物大大超过天然蛋白原有的电荷，从而消除或掩盖了不同种类蛋白质分子原有电荷的差异。并且SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的变化，在水溶液中都变成长椭圆形，其短轴长度都为1.8nm左右，而长轴长度则与蛋白质分子量成正比。故蛋白质在SDSPAGE中的泳动率不再受其原有电荷和分子形状的影响，而只决定于分子量。在一定分子量范围内，蛋白质的泳动率和分子量的对数呈直线关系。 浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 concentration gradientpolyacrylamide gel electrophoresis 用SDSPAGE测定蛋白质分子量，由于SDS及巯基乙醇的作用，天然蛋白质解离为亚基或肽链，因此测得的分子量不是天然的蛋白质分子量，要确定其真