乙肝病毒核酸扩增荧光检测.doc

1医院检验科 PCR室作业指导书 文件编号：ABCD-3-PR-28 版本/修订号：A/0 主题内容 乙肝病毒核酸扩增荧光检测 生效日期 第 PAGE 59 页 共 NUMPAGES 90 页 乙肝病毒核酸扩增荧光检测 目的：保证HBV DNA检测结果准确、可靠。 适用范围：HBV DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。 负责人：1 操作人：1 1 1 原理：本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测丙型肝炎病毒cDNA。 性能参数：检出低值＜1×103基因拷贝/ml。 标本要求： （1）标本类型：血清。 （2）标本采集：见标本采集手册。 （3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。 （4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。 容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管 所需设备：ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯 试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；HBV-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×108基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；阴性质控品（250μl/管）1管。 校准程序（计量学溯源性）：送深圳市计量检测所校准。 程序步骤:： 11.1标本处理：取血清标本40μl，加等量DNA提取液打匀。（提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。）沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），（为保证病毒颗粒充分裂解可转至4℃静置8~12小时）。10000rpm离心5分钟，取上清2μl做PCR反应。 11.2标准品稀释和处理：将阳性定量质控标准品（1×108基因拷贝/ml）6000rpm离心数秒标示为108，另取4支灭菌新0.5ml离心管，分别加入45μl阴性质控品，依次标示为107~104。吸取108管5μl至107管，用加样器反复混匀后换新吸头取5μl至106管，依次方法稀释至104管。-20℃保存；分别吸取稀释好的阳性标准品梯度和阴性质控品管各40μl，加等量DNA提取液打匀，以下步骤同上处理。 11.3PCR扩增：取HBV-PCR反应管若干管，直接加入处理后的样品管或阴阳性质控标准品2μl，6000rpm离心1分钟。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性定量质控标准品梯度以及未知标本，并设置样品名称，标记荧光基团种类和循环条件：ABI GeneAmp 5700的循环条件：93℃→2分钟预变性，然后按93℃45秒→55℃60秒，先做10个循环，最后按93℃30秒→55℃45秒，做30个循环。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。 11.4结果分析条件的设定：ABI GeneAmp 5700的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图象调节baseline的start值（2~4），stop值（7~9）以及Threshold值，使Std curve窗口下的标准曲线达到最佳（correlation数值介于-0.97~-1之间，correlation数值等同于|r|），最后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（Qty）。 质量控制程序： 阴性质控品：全部阴性 阳性定量标准品：全部阳性 ︱r︱≧0.97(correlation 数值介于-0.97~-1); 108至104基因拷贝/ml的阳性标准品检测的定量值与理论值相比误差小于±300%。 干扰（如乳糜血、溶血、胆红素血）和交叉反应：乳糜血、溶血、胆红素血基本不影响本实验的测定。 生物参考区间：正常人样本为阴性或0基因拷贝/ml。 患者检验结果的可报告区间：Ct值40，实验样本的HBV DNA含量（基因拷贝数/ml）=M；Ct值=40，样品 HBV DNA含量1 ×103基因拷贝/ml。 警告/危急值（当适用时）： 实验室解释：为乙型肝炎感染的辅助诊断以及治疗提供分子生物学上的参考依据。 其它：《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》见试剂盒