DNA甲基化及其检测教案资料.pptVIP

DNA甲基化及其检测方法;纲 要;;现象2：同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。但他们往往在长大成人后在性格、健康方面往往存在很大差异。; 现象3： 肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性，而基因的DNA序列并不发生变化。 ;现象4：橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，其实味不同。同一种水果，在不同产地生长，其味道，大小，外观可能相差很远。;Basket ball player？;基因;; 什么是表观遗传学？ ;表观遗传学/Epigenetics;在细胞基因组上存在两类信息： A- 遗传学信息 B- 表观遗传学信息 前者——维持细胞活性功能工厂的所有物质材料 后者——怎么建、何时建、在哪建的附加信息;DNA sequence coding;DNA甲基化 染色质重塑 RNA调控（RNA干扰， 非编码RNA:microRNA, long non-coding RNA等) ; 二、 DNA甲基化 ;DNA甲基化;DNA 甲基化的概念及机理;高等生物基因组甲基化特点;CpG岛(CpG islands) 在结构基因5’端附近的调控区段， CG二联核苷常常以成簇串联的形式排列，含量大于50%。 预测软件 http://pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/;可遗传性;DNA的甲基化如何调节基因表达？;启动子高甲基化使基因表达受抑制;; 三、DNA甲基化检测手段 ;; 主要检测途径; 3-1基于重亚硫酸盐转化的方法;基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理1;基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理2;应用一: 直接测序法（Direct sequencing);直接测序法;图6 PMVK基因扩增产物反向测序结果;图7 TRIB3基因扩增产物正向测序结果;应用二： 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequence PCR，BSP) ; 注： A：癌组织；B：癌旁组织；○-：未甲基化；●：甲基化;BSP克隆测序甲基化率三维图形;应用三： 甲基化特异性PCR (methylafion-specific PCR，MS-PCR) ;甲基化特异性PCR ; U M U M U M ladder ; MSP扩增产物凝胶电泳图;甲基化特异性PCR;应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA);结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法;基???限制性内切酶的工具酶;基于限制性内切酶的甲基化分析方法;MSRE-PCR原理;;图1-3：DNM基因琼脂糖凝胶电泳图;结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法;优点： 可同时检测基因组内多个CpG位点。实验结果易解释，成本低廉。 缺点： ①由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序列的CG将被忽略； ②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意； ③需要样本量大； ④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题； ⑤不适用于混合样本。 ;应用五：甲基化敏感性单链构象分析（methylation specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）;;甲基化敏感性单链构象分析;应用六：基于亲和纯化的甲基化分析方法;基于亲和纯化的甲基化分析方法;应用七：ChIP-Seq技术; ChIP-Seq;应用八：芯片技术在甲基化检测中的应用;启动子区甲基化芯片技术;基因芯片杂交信号图; ; HRM技术： 用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点 鉴定感兴趣的CpG 岛 。; HRM技术原理 ;HRM技术原理 ; HRM特点 ;应用十：焦磷酸测序法 ; ?是由4种酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应 ?每一轮测序反应体系中只加入一种dNTP。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的 ?ATP硫酸化酶催化PPi与5’-磷酰硫酸（APS）结合形成ATP，然后在荧光素酶的催化作用下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。CCD感应器检测到