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液相色谱质谱分析;一、 液相色谱概述 二、 HPLC仪器构成 三、高效液相色谱法的类型及分离机理 四、色谱分离方法的选择 五、质谱仪;一、 概 述; 高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流 动相的快速分离分析色谱技术。具有高压、高速、 高效、高灵敏度的特点，对于那些沸点高，热稳 定性差，相对分子质量大的有机化合物如烷烃、 烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均 可进行分离分析。 ;1）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10cm3·min-1. 2）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 ;3）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 4）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。;2 、液相色谱仪器（high performance liquid chromatograph）;液相色谱仪（2）;液相色谱仪（3）;液相色谱仪（4）;二、 HPLC仪器构成;2 、 HPLC仪器组成： 高压输液装置 →进样系统 →分离系统→ 检测系统 ;高压输液系统;流动相过滤与脱气装置 流动相过滤装置 分为在线过滤和真空过滤 流动相脱气装置 分为在线真空脱气和超声波脱气;泵体材料耐腐蚀;梯度淋洗装置 ;等度洗脱与梯度洗脱;;1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。 2) 适用于所选择的检测器。 3) 化学惰性好，以免破坏固定相。 4) 低粘度，增加样品的扩散系数??提高柱效。 5) 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。;(2) 进样系统; 准备状态 进样状态;?六通阀进样 装置的使用及保养;(3) 分离系统;1．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有 一定的溶解度)。 2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱 柱的pH范围。 3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。 4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理。 5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱 子冲洗干净，并保存大乙腈中。 6．压力升高是需要更换预柱的信号。;(4) 液相色谱检测器;a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机 化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm ×10mm，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变 化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 ;b. 光电二极管阵列检测器;两种检测器的色谱图 (a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器;紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。 流动相选择有限制。;类 型 主要分离机理 主要分析对象或应用领域 吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备 分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备 凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定 离子交换色谱 库仑力 无机离子、有机离子分析 离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析 离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析 疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化 手性色谱 立体效应