实验蔗糖酶提取.pptVIP

* * 蔗糖酶的提取 实验一 细胞破碎的常用方法 机械法 非机械法 液体剪切法 固体剪切法 超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法 压力和研磨 物理法、化学渗透法、酶溶 一、实验目的和要求 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。 二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 2、蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。 由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 市售干酵母粉 10g/组(3～4人） 2、实验试剂 ⑴ 石英砂， ⑵ 95% 乙醇(-20℃）， ⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 1、电子天平（称量样品）； 2、研砵（每组一套）； 3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）； 4、托盘天平（离心管平衡用）； 5、高速冷冻离心机； 6、恒温水浴箱（50℃）； 7、制冰机； 8、1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 ； 9、7ml离心管（留样品Ⅲ用）及离心管架 ； 10、－20℃冰箱。 五、实验操作方法和步骤 分组操作：每组3～4人。 1、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉10g，约3-5 g石英砂放入研钵中直接干燥充分研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积30-40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I）,另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS分析。 2、热处理： 将上一步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml离心管中，平衡后， 4℃，15000r/min离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS分析。 *