2017年主管检验技师考试临床免疫学和免疫检验讲义第十三章免疫组织化学技术.docVIP

第 PAGE 1 页 共 NUMPAGES 3 页 · 第十三章　免疫组织化学技术 　　免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。 第一节　概述 　　免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。 　　一、标本的处理　　（一）标本的主要来源　　1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。减少对组织标本的损伤与挤压。　　2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。　　3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。 　　（二）标本的固定与保存　　1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。　　2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。 　　3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。首选冷冻切片。其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。切片薄而有连续性，可长期保存。但对抗原的保存不如冷冻切片。 　　二、抗原的保存与修复　　在制片过程中，由于广泛的蛋白交联可使组织中某些抗原决定簇发生遮蔽，致使抗原信号减弱或消失。因此，使组织抗原决定簇重新暴露，即抗原修复是免疫组织化学技术中的重要步骤。常用的抗原暴露、修复方法有：酶消化法；盐酸水解法；微波法；高压锅法；煮沸法。 　　三、抗体的处理与保存　　（一）抗体的选择：多克隆抗体广泛用于石蜡包埋的组织切片，假阴性几率低，但特异性不如单克隆抗体，有时会造成抗体的交叉反应。单克隆抗体特异性强，但敏感性不够高。 　　（二）抗体的稀释：抗原抗体反应要求有正确的比例，过量或不足均不能达到预期结果。故需进行预实验，摸索抗体的最佳稀释度。　　（三）抗体的保存：保存抗体时，要注意保持抗体的生物活性，防止抗体蛋白质变性，否则会降低抗体效价，甚至失效。 　　四、免疫组化的结果判断　　（一）对照的设立：设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体进行，常用的对照有阳性对照和阴性对照。　　1.阳性对照 采用已知抗原阳性的标本与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片的阳性将证明整个显色程序的正确。尤其在待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。　　2.阴性对照 用确证不含已知抗原的标本作对照，结果呈阴性。只有在阴性对照成立时，方可判定检测结果。主要目的在于排除假阳性。　　（二）阳性结果：阳性细胞的显色分布有三种类型：①细胞质；②细胞核；③细胞膜表面。免疫组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。 　　（三）阴性结果及抗原不表达：阴性结果不能简单地认为具有否定意义，即使只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也应视为阳性表达。　　（四）特异性和非特异性显色的鉴别：特异性反应常分布于特定抗原部位，具有结构性，显色强度不一。非特异性反应无一定的分布规律，常为切片边缘、刀痕或皱褶部位，坏死或挤压的细胞区域，常成片均匀着色。　　非特异性反应　由于细胞内抗原含量不同，特异性反应的显色强度不一。如果细胞之间显色强度相同或者细胞和周围结缔组织无明显区别的着色，常提示为非特异性反应。　　其他　在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色，有时可见非特异性显色和特异性显色同时存在，过强的非特异性显色背景可影响结果判断。 　　（五）免疫组化结果与苏木素-伊红染色（HE）切片结果：当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应结合临床资料，如性别、年龄、部位、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能简单地用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。 　　五、质量控制　　抗体