Westernblot蛋白质双向电泳的原理方法和在医疗中的应用.ppt

Westernblot蛋白质双向电泳的原理方法和在医疗中的应用;*;*;*;*;*; 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 ; 蛋白样品的制备;*; 优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便 ; 优点： 1. 免疫特异性不受标记影响 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） 3. 多种标记的二抗可供选择 4. 可选择不同的Marker 缺点： 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2. 额外的二抗孵育以及条件优化;直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，所以一般情况下都采用间接法进行检测; Western Blotting间接法操作流程;;*;预混分子量标准 高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准 预染分子量标准 单色预染 多色预染 修饰分子量标准 糖基化 磷酸化 荧光标记 ;高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准;单色预染 多色预染;糖基化 磷酸化 荧光标记;; 选择标准 1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小） 2.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好） 3.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜; 膜的特点;作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。;;*;*;第一向：等电聚焦;聚丙烯??胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联剂N,N-甲叉丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N’—四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。;;*;*;*;目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术 能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析 ;等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离;硝酸银染色图谱;; DIGE图谱;双向电泳的最关键步骤之一 制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质 ;;变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或?-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。 ;起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。 ;通过10000V高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦 步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度来确定。 ;理想显色剂的7S 安全（safety） 灵敏（sensitivity） 简单（simplicity） 特异性（specificity） 快速（speed） 稳定（stability） 兼容性（synergy） ;硝酸银染色 优点：