大鼠灌注固定取脑解剖取材.ppt

大鼠灌注固定取脑解剖取材; 用途 1.用于常规HE染色，免疫组化分析。2.冰冻切片可以不做脑组织固定。3.不可用于western blot和PCR。4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注 固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。;原理 心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死 亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶 现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚 甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的 原位和表面结构不变，从而能使其对应的??体，准确检测其表达的位置和量。 ; 必要性 1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供 也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。 2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响;流程麻醉 开胸 心尖向左心室穿针 剪开右心耳 生理盐水冲洗 4%多基甲醛固定 取脑 保存或切片.;具体过程 大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。;1.多聚甲醛的配置： 一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装 有500mlDEPC水的玻璃容器烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅 拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4， 使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴 或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温 或4℃保存备用。 简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱 密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时 震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。 也可用10%福尔马林溶液，甲醛1：10稀释 甲醛100ml 磷酸二氢钠4g 磷酸氢二钠6.5g 蒸馏水900ml 或甲醛100ml加900mlPBS缓冲液。 ;2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。 3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用止血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯 剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断 膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏， 直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。 5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液 体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的 有效观察指标。 6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。 7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间2h， 过夜最好; 省时省剂的方法 夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定 的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水 约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白即可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组 织白而硬;大鼠脑组织取材步骤;2.用钩镊再眼眶处固定大鼠颅骨，用组织剪再颅骨和颈椎连接处剪断;3.组织剪头部伸入枕骨大孔，尽量贴着骨头（不能插太深伤到脑组织）。;4.组织剪从枕骨大孔处伸入，朝向同侧眼眶方向，贴着骨头剪，剪到眼眶;5.从大鼠眼眶之间剪断; 6.左手持钩镊插入大鼠的眼眶固定颅骨，用弯钳直接夹住枕骨大孔处的骨头直接就掀起来了;从小脑处将脑组织向上推起，用小剪刀剪断脑神经;注意事项 1.多聚甲醛气味刺激，配置时做好自我保护。 2.暴露心脏这一步骤，容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸”，人工气胸后，肺萎缩，胸腔里的空间增大，提拉剑突后，不容易损伤