基因工程-重组体转入受体细胞.pptVIP

第五章 重组体导入受体细胞 二、重组DNA导入大肠杆菌 2. 菌种 3. 制备原理 4. 制备过程 二、重组DNA导入大肠杆菌 转染(transfection) 转染是转化的一种特殊形式。 由transformation（转化）和 infection（感染）两词构成。 原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。 通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。 将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。 2. 转化率 （1）热休克法 （2）电转化法 4. 平板培养基培养细菌 5. 影响转化率的因素 （2）感受态细胞 （competent cells) 6. 体外包装的噬菌体的转导 （2）cI857基因突变的?噬菌体 （3） 互补型噬菌体 (4) 体外包装过程 （5） 转导 第二节 外源基因导入真核细胞 第二节 外源基因导入真核细胞 2. 酵母的转化方法 （2）利用Li+盐进行转化 二、导入植物细胞 2. 电击法（electroporation) 3.基因枪法（gene gun） 三、导入哺乳动物细胞 （2）特点： 2. 脂质体（lipofectin）载体法 3. 显微注射法(microinjection) （1）利用原生质球进行转化 酵母 原生质体 感受态 酶去壁 CaCl2、 PEG 插入外源基因 的酵母载体 PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。 CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。 转化 酵母 0.1mol/L LiCl处理 插入外源基因的酵母载体 感受态 40% PEG （聚乙二醇） 叶盘 消毒 切取 土壤农杆菌浸泡 看护培养基 愈伤组织 分化幼苗 1. 叶盘法（leaf disk) 植物细胞 原生质体 纤维素酶和果胶酶 DNA 混合入电击缓冲液 1-2kV,3-25?F电击 愈伤组织 幼苗 分化 又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles) DNA 1.2?m钨弹头 吸附 特制手枪 射击植物 装入 基因枪 （1）原理： 1. 磷酸钙沉淀法 HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。 依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。 不需要载体。 脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。 脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。 * * 第一节 重组体导入细菌细胞 第二节 重组DNA导入真核细胞 第一节 重组体导入细菌细胞 一、感受态大肠杆菌的制备 1. 目的 增加受体菌细胞膜的通透性。 一、感受态大肠杆菌的制备 第一节 重组体导入细菌细胞 使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 培养大肠杆菌 OD600至0.3-0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集菌 用冰冷的60mMCaCl2重悬 4℃离心收集菌 4℃离心收集菌 分装、-70 ℃冻存 用冰冷的60mMCaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的60mMCaCl2重悬 （1）转化（transformation) （3）转染（transfection) 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （2）转导（transduction) 转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 转化(transformation) 转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用 转导(transduction) 例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。 转化（transformation) λ噬菌体的生活史 例 转导（transduction) 每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 3. 转化方法 简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?gDNA）。 （2）电转化法 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置10分钟 42oC 1分钟 加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 冰浴15分钟，2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2°C离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 分装成 50-300?L 电转仪调为2.5kV,25?F 脉冲控制器200-400? 0.5?g质