蛋白质含量测定-考马斯亮蓝法.pptVIP

实验十一 蛋白质含量测定 ——考马斯亮蓝法 实验目的 掌握考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量的原理和操作步骤; 进一步熟练分光光度计的原理和操作方法; 掌握标准曲线的制作和使用。 双缩脲（NH3CONHCONH3）：凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。 Folin—酚试剂法（Lowry法） Folin—酚试剂中的磷钼酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物），在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。该法的灵敏度是双缩脲法的100倍. 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法:染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比，灵敏度高比Lowry法约高四倍 实验原理 1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一. 考马斯亮蓝G-250染料，在游离状态下呈棕红色，在酸性溶液中当它与蛋白质结合后，变为蓝色，使染料最大吸收峰位置，由465nm变为595nm。 在595nm测定的吸光度，与蛋白质浓度成正比。 Bradford 法的突出特点: (1)灵敏度高。其最低检测蛋白质含量可达1mg，这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大