原核表达完全手册.docVIP

PAGE PAGE 3 根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在 大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让 外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：1.??与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathione?S?transferase,GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin,??Trx）和N利用质A（N??utilization??substanceA,??NusA）。2.??转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。3.??插入一个定位到周质空间的信号序列。 一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再 把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进 行表达。而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和 repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可 以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。 当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内 的拷贝数就可以增加到25-50。pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型， 在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。 在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是 将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的 菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步 抑制，质粒可以更稳定地存在。Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改 造，它们大致分为以下几个种类：1.??蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包括有B834, BL21, BLR, Origami? B, Rosetta?和Tuner?。因此在 纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。BL21(DE3)是应用最多的 表达的表达菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大 肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。它的缺失，可以保证质 粒的稳定。2.??保证所有细胞以同样量进行表达Tuner?株及它的衍生株（Origami? B和Rosetta?）是BL21菌株 的lacY1缺失突变型，在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有 细胞中表达。Lac渗透酶的突变使进入每个细胞的IPTG量都是一 致的，这样使蛋白表达浓度可以随着IPTG浓度而改变。通过对 IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。一般说来， 低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。3.二硫键形成与溶解性增强 二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也 专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还 原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，??Origami，Origami B和Rosetta-gami?。在这些菌株中表达蛋白，可以更大程 度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的 可能增加。4.??稀有密码子的补给 不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆 菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。Rosetta?是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA， 包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它们以氯霉素抗 性的质粒形式存在。Rosetta系列是来自BL21lacY1，所以它具有 BL21lacY1的所有特性。5.??硒蛋氨酸标记 B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。它在高度 特异活性35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。 常用的培养基有LB、TB、M9、M9ZB，LB因为其成本低廉所以应用最为广泛， 各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题，当有了其它多种表达系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白的首选。 在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手。做表达？那是谋事在人，成事在天。有时候你把克隆做出来了，双酶切鉴定没问题，测序没问题，可是就是看不到表达带。原因当然可以分析，实验也是可以改进，但是窜改一下戈尔泰的话：“成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。”在实验遇到瓶颈的时候要如何进行分析，找到问题的症结是我们的实验关键所在。在准备进行原核表达的