转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达.pptVIP

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2019-09-23 发布于广东
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转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达.ppt

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转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因的克隆及表达制片：何颖舒冬梅王惜韩可以操作目的：采用RT-PCR技术，从黑曲霉的菌丝体RNA中扩散出葡萄糖淀粉酶GAT的结构基因，将其转接到pPIC9载体中，转入巴斯德毕赤酵母GS115中，获得重组酵母，使重组酵母中的葡萄糖淀粉酶活增高。基因载体：pPIC9 操作方法： 1.引物设计，根据已知的黑曲霉葡萄糖淀粉酶一基因序列和表达载体，pPIC9的克隆位点，利用DNAsis设计一对扩增葡萄糖淀粉酶一基因的引物，上游引物为5 ’ -TACGTAGCGACCTTGGATTCATGGTT - - 3’,带有SnaB一位点；下游引物为5 ’ -GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG - 3’,带有Not一位点。 RT-PCR扩增：首先，黑曲霉保藏菌种经查氏斜面培养基活化后，接种于100ml灭菌的黑曲霉液体发酵培养基中，加少量玻璃珠，200r/min、30℃，培养66~70h,以其为实验材料,利用总RNA提取试剂合提取黑霉的总RNA。再用RNA为模板，以下游引物进行反转录，获得cDNA第一条链。65℃热变性5min，冰浴，然后加入反转录酶，置于PCR仪中，30℃10min，42℃1h，94℃2min。表达载体的构建: C 转化子的筛选和鉴定（检） * * 再以反转录产物为底物，PCR扩增目的基因，反应条件为94℃3min热变性；94℃30s，54℃50s，72℃2min，40个循环； 72℃延伸10min。反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶试剂盒回收大约1.9kb的片段。将回收产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5a感受态菌，利用α互补法进行阳性克隆的初步筛选。筛选重组子的示意图基因工程的操作过程由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子转化子重组子目的重组子