实验一细菌的革兰氏染色.docVIP

实验一 细菌的革兰氏染色 生物科学 贺冰冰 040012010025 周二 9、0 节 一 实验目的 1 学习显微镜油镜的使用方法 2 学习微生物的无菌操作技术 3 学习细菌的革兰氏染色法 二 实验原理 1 显微镜及油镜物镜的使用原理 1) 油镜头的标志 油镜头上常刻有OI或 HI字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径最大，而工作距离最短。 2 ) 显微镜的分辨率 显微镜性能主要是看它的分辨率的大小，然后看它的总放大倍数。分瓣率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比：D=λ/2NA 2 细菌的革兰氏染色原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脱色，最后用复染剂番红复染。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类. G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三 实验器材 1 菌种：培养24h的枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆营养琼脂菌斜面培养物。 2 染色液和试剂： 生理盐水、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液, 香柏油，显微镜擦拭液. 3器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。 四 实验方法 1 涂片: 取一干净载玻片,中央滴一小滴生理盐水,无菌操作取菌 无菌操作(快):在酒精灯上灼烧接种环(注意手势)---松动试管帽---取下试管帽---灼烧管口---在火焰旁接种环通过火焰进入菌种管---接种环在管壁冷却---挑取菌少许---退出---灼烧管口---盖帽---涂片(调匀涂成薄膜)---灼烧接种环. 2 干燥: 室温自然凉干 3 固定: 手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）. 4 染色: 初染(加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,自来水水洗)---媒染(加碘液冲去残水,并覆盖一分钟,水洗)---脱色(将水甩净,衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出的酒精不出现紫色时为止,约20-30秒,立即用水冲净酒精)---复染(用蕃红液染2-3分钟,水洗) 5 干燥:室温凉干或吹风机吹干 6 镜检:先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，油观察细菌的形态。 五 实验现象 1 枯草杆菌 革兰氏阳性杆菌，杆形，不规则排列，紫色 2 金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性球菌，圆球形，不规则排列，紫色 3 大肠杆菌 革兰氏阴性杆菌，杆形，不规则排列，红色 六 实验结果及思考题 1　用油镜观察时玻片为什么要完全凉干? 答：当玻片未完全晾干时，残留的水会使折射率增大，使景象模糊。 2　叙述无菌操作时应注意的问题。 答：接种环在接种前后都需灼烧，试管盖不可随处放置，取菌株时需穿过火焰。 3　绘出所观察细菌的菌体形态并注明革兰氏染色反应阳性和阴性。 4 革兰氏染色成败的关键是什么? 答：把握好染色时间。 5 对一个未知菌进行革兰氏染色,怎样确定你的染色技术正确结果可靠? 答：在玻片上再各涂革兰氏阴性菌、阳性菌，其他处理方式与待验证菌株相同，观察结果，若对比组正确，则可判断其技术可靠。