第08章生化分离高级纯化技术.pptVIP

第一节 层析技术概述 第一节 层析技术概述 一、层析技术的原理 二、层析技术的类别 三、大规模生物分子纯化层析方法 一、层析技术的原理 1、层析的由来： 层析分离始于20世纪初，1903年俄国植物学家向填充碳酸钙的柱中注入植物色素的石油醚萃取物，发现柱中出现数条相互分离的色带，层析法（Chromatography）的命名由此开始，又称色谱或色层。 2、层析技术的原理 根据混合物中，溶质在互不混溶的两相之间分配的差别，引起移动速度不同而进行分离的方法（如下图）。互不相溶的两相分别称固定相（stationary phase）和流动相（mobile phase）。 料液中溶质在流动相和固定相之间发生扩散传质，产生分配平衡。分配系数大的溶质在固定相上存在的几率大，随流动相移动的速度小 ，溶质之间的移动速度的不同而分离。 柱层析设备和操作示意图 二、层析技术的类别 1、流动相与固定相 A、根据流动相的相状态：气相层析法、液相层析法、超临界流体层析法。 B、固定相为固体、液体和以固体为载体的液体薄层，分别为：吸附层析法、液体的分配层析法、液体薄层的分配层析法。 3、压力 以固体（包括以固体为载体的液体薄层）为固体相的液相柱层析中，根据操作压力不同，分为： 低压（小于 0.5 MPa）液相层析法 中压（0.5－4.0 MPa）液相层析法 高压（4.0－ 40 MPa）液相层析法 4、分配机理 根据溶质和固定相之间的相互作用机理（液液分配、各种吸附作用），液相层析法可分为： 凝胶过滤层析 亲和层析 离子交换层析 反相层析 疏水性相互作用层析 5、分离操作方式 操作方式不同： 洗脱展开层析（elution development） （洗脱层析）  迎头分析（frontal analysis） 顶替展开（displacement development） 6、料液流向： 三、适用于大规模生物分子纯化的层析方法 第二节 凝胶过滤层析 一、凝胶过滤层析的原理 二、凝胶过滤层析介质 三、凝胶过滤层析的应用和特点 一、凝胶过滤层析的原理 1、原理：凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography，GFC）又称分子排阻层析、分子筛层析，以凝胶颗粒为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析，当料液通过层析柱时，大于凝胶孔径的分子不能进入凝胶孔内，被凝胶孔排阻，只能在胶外颗粒之间的孔隙中流动和分配，流经路程短，很快被洗脱出来。小于凝胶孔的分子进入凝胶孔内，在凝胶孔内外分配，在凝胶孔内部穿行，移动速度慢，滞后流出，大小不同的分子得以分离。 洗脱体积（Ve）：在凝胶过滤层析中，使溶质从柱中流出 时所通过的流动相体积；外水体积（V0）：凝胶颗粒之间的空隙的总体积； 柱总体积（Vt）： Vt = V0＋Vi＋Vm 内水体积（Vi） ：凝胶颗粒内部空隙总体积； 凝胶体积（Vm）：凝胶颗粒基质本身所占的体积； 在限定的层析条件下，Vt和V0都恒定值，而Ve随水分离物分子质量的变化而变化。 讨论： （1） Kav ＝0时，则Ve＝ V0 ，洗脱体积等于孔隙体积，完全 排阻（组分Ⅰ） ； （2） Kav＝1时，则Ve＝ V0 ＋Vi ，洗脱体积等于孔隙体积和内水体积之和，小分子完全进入凝胶内部（组分Ⅲ）； （3）0＜ Kav ＜1，内水体积只有一部分被组分利用，扩散渗透 （组分Ⅱ）。 料液体积小于洗脱体积时，两种溶质才可能完全分离。 溶质的分配系数只与相对分子质量、分子形状、凝胶结构（孔径大小）有关，与洗脱液的PH值和离子强度等物性无关。 洗 脱 曲 线 2、凝胶过滤介质 （1）介质种类 A、琼脂糖凝胶（Sepharose）： 除凝胶过滤层析(GFC)外，琼脂糖凝胶化学修饰后主要用于离子交换层析、疏水性相互作用层析及亲和层析。 B、Sephadex G： 利用葡聚糖交联制备。交联剂一般用环氧氯丙烷（epichloryohdrin）,用量越大，交联度越高，凝胶网状结构越紧密，吸水量小，分为G10—200八种型号。 C、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）： （2）凝胶特性参数 A、排阻极限（exclusion limit）： 是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量。不同凝