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牙髓间充质干细胞生产 目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。 范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产；适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员。 职责： 生产主管负责本制度的执行和监督； 技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作； 监督员负责全程监督，并即时按要求填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》。 附表1 牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录 附表2 生产试剂耗材记录表 规程： 一、牙髓间充质干细胞原代操作 消化法： 1.仪器耗材 1）10ml移液管 培养皿 50ml离心管 100μm筛网 T75培养瓶 15ml离心管 2.试剂 1）生理盐水 2）培养基 3）胶原酶 3. 酶消化法操作流程 3.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min； 3.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 3.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3 ，转移到50ml离心管中，加入生理盐水至30ml,再加入10ml 0.2%胶原酶； 3.4 置于37℃恒温摇床，180rmp消化30min ； 3.5 用100μm滤网过滤； 3.6 1200 rpm离心10min ，吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》； 附表3 样本取样单 3.7 弃剩余上清，调整细胞浓度为107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37℃，CO2培养箱中进行培养。 4. 组织块法操作流程： 4.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min； 4.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 4.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3 ，将组织块均匀铺到T25培养瓶（用适量FBS润湿瓶底）瓶底； 4.6 倒置培养瓶，并加入5ml培养基，放入培养箱中培养； 4.7 12-24h后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。 二、牙髓间充质干细胞换液 1.耗材 1）10ml移液管 2）15ml离心管 2.试剂 培养基 3. 操作流程 3.1 镜下观察状态细胞； 3.2 吸取上清液4ml交给质检，并填写《样本取样单》； 3.3 吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），并补充新的培养基； 3.4 观察细胞并将其置于37℃，5%CO2孵箱中培养。 三、牙髓间充质干细胞传代培养 1. 耗材 1）10ml移液管 2）50ml离心管 培养瓶 15ml离心管 2. 试剂 1）生理盐水 2）胰酶 3）血清 4）培养基 3. 操作流程 3.1 显微镜观察，观察培养瓶中的细胞密度到达80%—90%，可进行传代培养； 3.2吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤贴壁细胞； 3.3 吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》； 3.4 倒出剩余洗涤液（生理盐水），再加入10ml生理盐水+0.05%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化； 3.5将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，6min，弃上清，重悬，加入培养基，然后按照1:2或1:3进行传代。 四、 牙髓间充质干细胞成品制备 1. 耗材 1）10ml移液管 2）50ml离心管 3）15ml离心管 4）西林瓶/输血袋 2. 试剂 1）生理盐水 2）胰酶 3）血清 4）干细胞保存液 3. 操作流程 3.1 待细胞扩增总数达所需细胞数量后，吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤一遍； 3.2 加入10ml生理盐水+0.05%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化； 3.3 将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，10min； 3.4 弃上清，细胞沉淀用30ml生理盐水洗涤二次，1200rpm，室温离心10min。 3.5 取第二次洗涤离心后的上清20ml交给给质检部分，并填写《样本取样单》； 3.6用干细胞保存液/生理盐水重悬细胞，转入专用的无菌西林瓶/生理盐水中，封口，贴标签，放置4℃保存。 3.7 完成初包装后，操作员立即将成品送交包装部门。 牙髓间充质干细胞的冻存 1. 耗材 1）10ml移液管 2）50ml离心管 3）15ml离心管 4）冻存管 2. 试剂 1