NK细胞毒活性课件.pptVIP

NK细胞毒活性;;器材 75%酒精 若干 无菌纱网 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌吸头（大、中、小）3盒/room 无菌96孔培养板 1块/组 可调微量加样器 1套/组 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 EP管 若干 眼科剪、小镊子 1套/ 组 细胞培养箱 1台/room 酶标仪 1台 离心机 2个/room 超净台 1台/组; NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。 ;密度梯度离心 Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心 磁化细胞分离器分离法 ;同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR 　　 乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用) ;G0;应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)，即可计算出NK细胞活性。;乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。 ;靶细胞 YAC-1;操作流程 ;单细胞悬液的制备 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细??。 细胞计数： 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 调脾细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为1ml 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml 注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。;细胞培养： 按图所示加板。 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%CO2培养箱中，培养2小时。 LDH底物： 在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物 100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。 室温避光保存15min。 取出，加入1mol/L柠檬酸， 30?l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。 结果测定： 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。 结果判定： Max （ 靶细胞最大释放）=最大释放孔均值-最大释放对照孔均值 S自发 （靶细胞自发释放） =自发释放孔均值-培养基对照孔均值 注： S自发 ＜0，做“0”处理;; 结 果 处 理; Excel 作 图