双向电泳的技术流程和样品制备.PPTVIP

文库专用 * 有机染料和银染 考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。 胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为8~10ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。 胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。 银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。 这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。 文库专用 * 负 染 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。 结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。 速度快（5~15min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。 它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。 该技术主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用。 文库专用 * 胶体扩散染料 主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。 最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。 这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。 文库专用 * 有机荧光团染料 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料。 这三种染料可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成，灵敏度为2~10ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。 这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。 文库专用 * 金属螯合染料 这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。 其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发光染料。 文库专用 * 凝胶的图像处理分析和 典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立： 文库专用 * 蛋白质的胶内酶切 包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程 文库专用 * 质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程 样品制备 与IPG胶条水化 IPG电泳 与上样缓冲液浸润 SDS转PVDF膜 胶内直接染色 染色 取出蛋白点 胰酶等消化 浓缩于多孔吸附柱上 MALDI-MS肽指纹图 数据库查询 蛋白质鉴定 已知 反向HPLC分离 MALDI-MS，PSD片段分析 示知 ESI-MS-MS、微测序 文库专用 * 实验方法 完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质） 肽混合物 质谱测定肽质量 （MALDI-MS,ESI-MS) 选择肽段裂解 PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS) 计算方法 蛋白质序列数据库（＋核酸序列翻译数据库） 肽质量检索：片1.ppt 未解析碎片离子检索：片2.ppt 酶切 质谱鉴定蛋白质的策略 文库专用 * 体外 pmol [32P]蛋白质标记 蛋白质分离 蛋白酶切 2D磷酸化做图 ?LC-ESI-MS或MALDI-MS ?LC-ESI-MS ?HPLC IMAC 磷酸化氨基酸分析 体内 [32P]细胞标记 蛋白酶切 2D磷酸化做图 相关分析 磷酸化位点分析策略 文库专用 * 非变性2D：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； 非变性/SDS-2D：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。 非变性/还原/SDS-2D：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。 变性2D：样品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃变性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后进行SDS。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式