可以对寡核苷酸测序-昆明医科大学.PPT

第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis  钟树荣副教授 昆明医科大学法医学院;DNA序列测定（Determination of DNA sequence ）;DNA测序技术（DNA sequencing technology ）;测序（sequencing ）的常用方法;一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法); 化学裂解法测序（Chemical pyrolysis sequencing ）的原理;表----特异断裂4种脱氧核苷酸的方法;在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是： G反应----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应----在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。;碱基特异性修饰及裂解 （Base specific modifications and cracking ）;（一）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料。 （二）碱性磷酸酶处理消除5’磷酸。 （三）多核苷酸酶催32PdNTP标记（5’-OH）末端。 （四）使标记片段变性为单链。 （五）分成4-5个反应体系，按上述程序（表或4个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），DNA链上每50-100碱基只有1个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。 （六）电泳 （七）放射自显影 （八）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出。;化学法测序的基本步骤;;二、Sanger双脱氧链终止法 ;Sanger双脱氧链终止法（Sanger dideoxy chain termination method ）;Sanger双脱氧链终止法;;三、DNA自动测序（automatic DNA sequencing ） ;DNA测序自动化和大规模测序的特点;DNA自动测序;Four color fluorescent dyes(BigDye)Mark end item;DNA测序基本步骤（Basic steps in DNA sequencing ）;DNA sequencing pruduct purification;DNA number of sequenced templates;Sequencing reaction systemand condition;Sequencing reaction;;single-cell ge l electro phoresis--377;single-cell ge l electro phoresis--310;single-cell ge l electro phoresis--3100;Step１：The capillaries glue;Step２：specimen disc move;Step３：electrophoretic injection and electrophoresis;Step４：Fluorescence excitation and detection;DNA automatic sequencing result;DNA automatic sequencing result;DNA sequencer 的多种应用