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细胞生物学实验报告 利用MTT比色法测定细胞群体的相对细胞数量 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内(OD值在0.7以内)，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 MTT比色法的影响因素 （1）溶剂溶解甲瓒能力不同。 （2）培养基中的酚红、血清和PH变化可能影响OD值。 （3）DMSO溶解能力强，但是可能与残留MTT发生反应，随着时间延长不断加深。 二、实验目的 1.熟悉掌握细胞传代培养 2.学习和掌握细胞生长速率的测定 3.学会用MTT法检测细胞的生长状况 4.了解MTT法在生物学研究中的应用 三、实验器材 （1）仪器? CO2培养箱，倒置显微镜，超净台? （2）材料? 培养瓶，试管，移液管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，96孔板，HeLa细胞 滴管，V型槽。 （3）试剂? 完全培养基（DMEM），胰蛋白酶，小牛血清、胰酶 四、方法与步骤 （1）入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。要用肥皂洗手,用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。 （2）关闭已照射超净台台面20分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。打开照明灯。 （3）超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。 （4）准备好所需试剂及仪器，摆放在超净台中。 （5）对细胞进行传代并计数，将其稀释成8×104个/ml，并将其按下表所示浓度接种细胞于96孔板； 96孔板设计（溶液为200μL） 1 2 3 4 5 6 A 无细胞 细胞原液 2倍稀释 4倍稀释 8倍稀释 16倍稀释 B 无细胞 细胞原液 2倍稀释 4倍稀释 8倍稀释 16倍稀释 C 无细胞 细胞原液 2倍稀释 4倍稀释 8倍稀释 16倍稀释 D 无细胞 细胞原液 2倍稀释 4倍稀释 8倍稀释 16倍稀释 E 无细胞 细胞原液 2倍稀释 4倍稀释 8倍稀释 16倍稀释 F 无细胞 细胞原液 2倍稀释 4倍稀释 8倍稀释 16倍稀释 G 无细胞 细胞原液 2倍稀释 4倍稀释 8倍稀释 16倍稀释 H 无细胞 细胞原液 2倍稀释 4倍稀释 8倍稀释 16倍稀释 【注】第7至11列与第2至6列相同，第12列与第1列相同； （6）检测：弃去旧培养基，加入100μL含MTT的培养基（5mg/mL MTT:培养基=1:10）； （7）孵育4hr，然后加100μL裂解液过夜； （8）用酶标仪测OD值，检测波长为570nm； 五、实验结果及分析 实验结果： 表二：实验组1 OD值结果 1 2 3 4 5 6 A -0.094 0.113 0.047 0.241 0.033 -0.030 B -0.096 0.166 0.024 0.319 0.174 0.111 C -0.087 0.288 0.025 0.306 0.192 0.096 D -0.097 0.459 0.407 0.344 0.183 0.143 E -0.074 0.531 0.057 0.343 0.184 0.163 F -0.074 0.386 0.000 0.396 0.191 0.126 G -0.092 0.341 0.047 0.289 0.127 -0.015 H -0.050 0.030 0.031 0.298 0.162 -0.138 平均值 -0.083 0.289 0.080 0.317 0.156 0.057 表三：实验组2OD值结果 7 8 9 10 11 12 A 0.166 0.114 -0.027 0.056 -0.059 -0.063 B 0.328 0.795 0.020 0.018 -0.006 0.057 C 0