cdna文库的构建和筛选.ppt

第五章 cDNA文库的构建和筛选;;细胞中总 RNA;信使RNA的表达在生物体内具有组织和时空特异性。因此， mRNA对于了解细胞中的信息流非常重要. ? Size – examine differential splicing（检测可变剪接） ? Sequence – 预测蛋白产物 ? Abundance – 检测表达水平 ? Dynamics of expression – 不同的时间、发育阶段和组织的特异性。;第一节：将mRNA转变成cDNA;RNA;一、mRNA的分离纯化 RNA在体内具有容易被内切核酸酶（RNase）降解以及自然降解的特性。分离以及保存RNA需针对上述特点进行。 加入RNase抑制剂 ;;RNA 分离;? Total RNA from biological samples – Organic extraction – Affinity purification ? mRNA from total RNA – Oligo(dT) resins ? mRNA from biological samples – Oligo(dT) resins;从生物体内分离 total RNA（有机分离法）;用层析柱分离总 RNA;? mRNA的 3’ 末端具有polyA 尾巴 ? Oligo(dT) 探针用于分离总RNA中的mRNA ? mRNA can be eluted from oligo(dT) matrix using water or low-salt buffer;Messenger RNA Isolation;二、cDNA 的合成 A、用polyT作为引物;第一节：将mRNA转变成cDNA;B、用来自E. coli中的RNase H 降解的RNA充当引物，在DNA聚合酶和连接酶的作用下合成第二链DNA;cDNA文库的组建：; cDNA 文库的特点;第一节：将mRNA转变成cDNA;三、cDNA克隆载体;第二节 cDNA文库的筛选;某些基因编码的蛋白质的性质已知 通过氨基酸序列反推核苷酸序列 TGG-GAT/C-GAA/G-AAT/C-AAT/C-ATG 进行至少两轮的筛选才能获得阳性的克隆 ;B、利用抗体进行杂交;;C、利用同源基因中的目标基因序列;D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针;D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针;第三节 cDNA表达文库的筛选 研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用;1、噬菌体展示技术原理 A、噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达。 B、融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。 C、被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。;第三节 cDNA表达文库的筛选;第三节 cDNA??达文库的筛选;B、酵母双杂系统的组成部分 （1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）； （2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）； （3）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。 C、酵母双杂系统的工作原理 ;Gal4结合域;BD;用途： 快速筛选与一种已知蛋白结合的目的蛋白，发现新基因 验证 已知蛋白间的相互作用及作用强度;优点： 根据兴趣蛋白的基因序列 即可筛选与其作用的目的蛋白 蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来 可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。;局限性： 表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符，造成结果的不准确 本身就具有转录激活活性 的兴趣蛋白不适合于该系统 不能定位于核内 的兴趣蛋白不适合于该系统 需要翻译后修饰的蛋白 不适合该系统;;第五节：体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因;三、研究策略