基于聚苯胺纳米纤维复合膜界面构建电化学细胞传感器及其对癌细胞的识别检测.docVIP

基于聚苯胺纳米纤维复合膜界面构建电化学细胞传感器及其对癌细胞的识别检测 摘 要 合成了聚苯胺纳米纤维，直径在50～70 nm之间；基于静电作用构建聚苯胺纳米纤维-纳米金复合膜界面，并在此界面上层层组装修饰叶酸分子，构建叶酸功能化传感界面，基于叶酸分子与癌细胞表面过量表达的叶酸受体之间的特异性识别作用，将此传感界面应用于对癌细胞的识别和捕获。结果表明： 叶酸功能化传感界面能够特异性识别和捕获叶酸受体过量表达的癌细胞。采用电化学阻抗技术，以hela细胞为模型，应用于对癌细胞的识别和检测，细胞在1.0×104～6.4×106 cells/ml浓度范围内与阻抗变化值δrct呈良好的线性关系；检出限为2000 cells/ml。本方法简单、快速灵敏、重现性和稳定性良好；制备的传感器可以再生使用。 关键词 细胞传感器; 聚苯胺纳米纤维; 纳米金; 癌细胞 1 引 言 基于电化学检测的细胞传感器，是通过测量电化学信号（如电流、阻抗及电容等）分析评价细胞，目前已成为生物传感器研究领域的热点。电化学技术可对细胞生长发育以及细胞功能变化等方面提供相关信息。近年来，一系列电化学细胞传感器已用于对细胞的类别、浓度、活性、增殖、扩散、调亡及细胞内外分子的分布等的研究。电化学阻抗技术因其对细胞无创伤性及细胞在电极界面的高阻抗性而被用于研究细胞的生理学、形态学及细胞功能变化等。 目前，用于构建电化学细胞传感器界面的材料主要有壳聚糖、纳米金、碳纳米管等生物相容性好的材料。chen等基于键合生物相容性的壳聚糖（cs）和具有良好导电性的碳纳米管（cnf）形成复合膜，控制电沉积形成的cs-cnf纳米复合物膜具有良好的生物相容性，可用于固定k562细胞。zhang等基于功能化碳纳米管（pdcnx）、硫堇（th）和纳米金（aunps），通过层层组装方式形成三维结构基底，制备了可用于评价细胞表面p-gp表达量的生物传感器。ding等在丝网印刷碳电极上电聚合聚苯胺，利用电聚合聚苯胺界面吸附细胞，通过测量细胞吸附后阻抗的变化研究和监测k562细胞的粘附和增殖；实验表明，细胞可以在聚苯胺界面生长增殖，说明聚苯胺具有良好的生物相容性。目前，利用聚苯胺纳米纤维（pani-nf）作为基底材料构建电化学细胞传感器界面尚未见报道。 图1 叶酸的分子结构 fig．1 structure of folic acid（fa） 叶酸（fa），即维生素b9，是亲水性的小分子，其分子结构式如图1。叶酸受体（fr）被称作高亲和性叶酸结合蛋白，膜表面的fr可与fa特异性结合。fr在正常组织表达高度保守，而在大部分恶性肿瘤中高度表达, 有时比正常组织高100～300倍。 本研究将pani-nf与aunps复合形成纳米复合膜界面，在pani-nf/aunps界面上层层组装修饰上叶酸（fa），构建了新的传感界面电化学细胞传感器（图2）。以pani-nf为基底，具有高的比表面积和带正电荷，对aunps有较好的吸附能力，有利于界面修饰生物分子；同时用bsa封堵传感界面上空余的活性位点，提高传感界面的特异性识别能力，可应用于癌细胞的识别与检测，进一步应用于其它细胞功能性研究。 2 实验部分 2.1 仪器、试剂与材料 chi660a电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；tecnai-10透射电镜（tem，美国philips公司）； autoprobe cp research原子力显微镜（afm，美国thermo microscopes公司）。 苯胺、过硫酸铵（广州化学试剂厂），叶酸、谷胱甘肽、nhs、edc（ar，aldrich公司），其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。磷酸盐缓冲溶液（pbs，ph 7.4，含有8 mmol/l na2hpo4, 1.5 mmol/l kh2po4，137 mmol/l nacl和27 mmol/l kcl）。 hela细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞库）。人淋巴细胞和血红细胞由健康人外周血中分离获得。细胞培养所用培养液为rpmi1640（sigma公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。rpmi1640培养基在使用前加入新生牛血清和双抗储备液（青霉素十链霉素），使血清的含量为10%，青霉素和链霉素的终浓度分别为100 u/ml和100 mg/l。 2.2 复合膜修饰电极的制备 制备聚苯胺纳米纤维和纳米金参考文献。取10 ?symbolma@ l 0.2 g/l pani-nf溶液滴涂在新鲜玻碳电极表面，室温干燥后，浸入新制纳米金溶液（10