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第三十章 DNA的重组 简答题 1．请叙述克隆一个DNA片段的基本方法。 2．何谓限制性内切酶和甲基化酶？它们的功能是什么？ 3．何谓DNA克隆的载体（vector）？载体DNA应具备哪些特征？ 4．质粒（plasmids） 为什么可作为载体DNA？ 5．试比较噬菌体A和质粒作为克隆载体的优缺点。 7．请介绍农杆菌中Ti质粒的特性。 8．何谓基因文库？建立 DNA文库（基因组文库）的基本方法是什么？ 9．何谓CDNA文库？如何建立CDNA文库？ 10．何谓菌落原位杂交？ 答案 1. 　（1）选择合适的限制酶，以便定点切割靶DNA和载体DNA。 　（2）选择能够进行自我复制的小分子DNA，如质粒或病毒作为载体DNA。 　（3）制备所需要的DNA片段。 　（4）用DNA连接酶连接载体DNA和目的基因，使它们形成重组DNA分子。 　（5）选择合适的方法把重组 DNA分子送入细胞，由细胞提供 DNA复制的环境条件。另外，还要选择一种能够检测重组DNA是否进入细胞的方法，即筛选含重组子的细胞克隆。用于完成上述步骤及有关任务的方法统称为重组DNA技术。 2．限制性内切酶存在于许多种细菌中。这些限制酶的功能是识别和降解外来的 DNA，而细胞本身的DNA不被切割。这是因为存在限制性内切酶的细胞中还有另一种酶即共座甲基化酶，它能识别限制性内切酶所识别的核普酸序列，并把其中的某些碱基进行甲基化修饰，因而避免了限制酶对自身DNA的破坏；外来的DNA分子，因为没有甲基化标记，作为异己而易被限制酶切割。 3．要使外源DNA片段能在宿主细胞内复制，必须有特殊“载体” 的帮助。通过它，外源 DNA可进入受体细胞扩增。这种使外源 DNA得到克隆扩增的 DNA称为载体 DNA。载体DNA应具备下列特征： 　（1）是宿主细胞本来就具有的或是宿主细胞完全可接受的 DNA分子； 　（2）它的分子量要尽量小，它不仅能在宿主细胞内独立地进行复制，而且也能复制它所连接的DNA分子； 　（3）载体DNA经限制酶切割后，仍不失自我复制能力； 　（4）载体DNA应携带可供筛选的遗传标记，在外源DNA插入后，这些特征可作为重组DNA的选择标记。如 SC101质粒含有抗四环素的基因，质粒上有一个 ECORI酶切位点，酶切后不破坏抗四环素基因，结合外源 DNA后也不会损伤该基因。 　　在原核生物的DNA重组中常用的载体是质粒和噬菌体。酵母和动物病毒等常用作真核生物克隆的载体。 4．质粒是细菌染色体外的遗传因子，通常为双链环状的DNA。质粒能自主地进行复制，这 样它才能随着细菌细胞的分裂而稳定的遗传。在天然条件下，一些质粒可通过类似于细菌接合的方式从一宿主转移到另一宿主细胞，这类质粒称为游离体。但这类质粒不适合作载体，需经改造使之不在细胞间转移，以使危险基因不致被传递。通过“转化”，质粒进入细胞后，使受体菌获得新的遗传特性。因为质粒上往往携带一些特殊的基因，如有 些质粒上有产生大肠杆菌素的基因，使大肠杆菌可以分泌大肠杆菌素，以杀死外来的细菌。有些质粒上有“钝化”抗生素如四环素的基因，使大肠杆菌在含有四环素的培养基上仍能生长，此称为抗药性。这些特性可用于筛选获得重组子的克隆。 5．质粒作载体简单易行。质粒作为载体尽管有许多优点，但所携带的外源 DNA只限于10kb以内的小分子 DNA片段。因细菌转化的效率随着质粒分子量的增加而下降。一些较大的DNA片段可用噬菌体人作为载体进行克隆。使用噬菌体入作为克隆载体是基于它的三个重要的特性。 　（1）λ噬菌体颗粒中的 DNA是线状双链DNA，该病毒基因组中约 1／3的 DNA是非必须的，因此可以用外来的DNA替换之。 　（2）λ噬菌体可允许插入的 DNA长达 23kb，一旦人噬菌体的 DNA片段和大小合适的外源 DNA片段相连接，所产生的重组 DNA分子在加入含有完成噬菌体包装所需的所有蛋白质的细菌细胞抽提物时，它们能被组装成噬菌体颗粒。此过程叫做体外包装，这样获得的噬菌体就能把重组DNA分子送入细胞。 　（3）λ噬菌体侵染大肠杆菌，可以在宿主细胞内增殖，并使细胞裂解放出约100个噬菌体颗粒，使外源DNA得以克隆和扩增。 7．多数农杆菌中含有一个大的质粒（约200kb）叫做Ti质粒，Ti质粒上有一段DNA，称为 T－DNA（transferred DNA，约 23kb）；当农杆菌和一个植物细胞接触时，它所含的质 粒中的T－DNA片段在质粒转化入植物细胞中时，能整合到植物核染色体的随机位点，并导致冠瘿瘤的形成。T－DNA以外的一个约35kb的区域内含有毒性基因（Vir）。该毒性基因的产物对T－DNA的转移及整合是必需的。这个T－DNA编码的酶改变植物的代谢物，形成两种对细菌很重要的化合物。第一类是植物