分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(71).pptVIP

分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能 PCR实验中常见问题 及解决办法 李刚 副教授 标准的PCR反应体系  10×扩增缓冲液 　 10 μl  4种dNTP混合物 　 各200 μmol/L  引物 　　　　 　 各10～100 pmol　  模板DNA 　　　 　0.1～2 μg　 Taq DNA聚合酶 　 2.5 Unit　  Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L  加三蒸水或超纯水至50 μl。  PCR产物的电泳检测时间 　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。  　PCR反应有哪些关键环节？ ①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量；④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。  模板最容易出现的问题 一、模板含有杂质： ①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定,不宜随意更改。 二、模板发生变异： 如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失