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重组DNA技术--基因重组与基因工程 DNA重组的基本模式 (分)------目的基因及载体的分离 化学合成法 从基因文库中筛选 从mRNA反转录合成cDNA 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR） 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 载体DNA的选择 质粒载体的一般结构 切------限制性内切酶酶切 载体和目的基因的切断 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。 限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。 T-vector 接------载体和目的基因的连接 （二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。 （三）人工接头连接法： 将人工连接器（linker，即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子DNA片段，约10~20个核苷酸）连接到平末端DNA分子(载体和目的基因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。 转------重组体的转化 宿主菌或受体细胞 感受态细胞（competent cell） 大肠杆菌感受态细胞的制备( 化学方法) 真核细胞的转染 重组体克隆的筛选与鉴定 阳性重组子的筛选与鉴定 遗传检测法(根据重组载体的标志作筛选) --插入失活法 --α-互补法 限制性酶切法 PCR法 杂交筛选法 免疫学方 法 核苷酸序列测定法 遗传检测法 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端１４６个氨基酸偏码区（全长1201氨基酸） 。这个编码区中插入一个多克隆位点。 受体菌是Z基因突变型，只含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端aa的序列。当外源基因插入时，在IPTG （异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导下合成β－半乳糖苷酶N端片断，和受体菌的C端片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的β－半乳糖苷酶，称α互补。 具有α互补的细菌培养在含IPTG及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培养基上。 X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。 IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。 限制性酶切法 杂交筛选法 免疫化学检测法 DNA序列分析法 真核细胞的筛选 外源基因在宿主细胞中的表达 原核生物基因结构和表达特点 影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 真核基因结构及表达调控特点 滤膜（固定抗体） + 该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。 ACTGAAGGCT 新霉素抗性选择系统： 新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制作用，但新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核细胞中表达并能使G418失活（neo基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。 真核细胞的筛选标记 新霉素类药物 G418筛选 Am Neo P ori G418 灭活 （-） 蛋白质合成 tk- 细胞突变株筛选转染细胞 选择原理： tk(胸苷激酶)基因的筛选：受体细胞必须是相应的tk-，将细胞培养在含HAT（H：黄嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三种核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk基因的存在细胞才可生长。 氨基喋呤筛选法 氨基喋呤 (HAT选择) 核酸从头合成 （-） 核酸补救合成（TK酶） TK- TK+ DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载