L5-三章测序与合成.pptVIP

第三章 核酸分析与合成第一节 核酸序列分析 1975年，Sanger加减法 Maxam-Gilbert化学法 1978年， Sanger末端终止法， 1958 胰岛素顺序+1980 测序 一、加减法 1、原理 *0-系统:不等长度片段 *加法：T4 DNA Polymerase+1dNTP(3’?5’外切 5’ ? 3’聚合） *减法：DNA PolymeraseI +3dNTP 2、应用举例 0-系统的产生 加法系统与减法系统 5’标记后电泳、放射自显影：读序与模板的关系、加减系统存在的必要、0系统存在的必要 二、特异化学试剂裂解法 1、原理:化学修饰碱基-糖苷键和磷酸酯键不稳定而水解 2、特异化学试剂裂解 嘌呤-硫酸二甲酯 嘧啶-肼和呱啶 *裂解G和A的反应（GA） *强化A的裂解（AG） *裂解C和T的反应 *裂解C的反应 举例 三、末端终止法 DNA聚合酶I及 2’, 3’-双脱氧核苷酸（ddNTP） 1、原理（genetic-rec-seq） 2、单链的产生：M13 3、停止与压缩反应 停止-M13的二级结构，阻止延伸-提高温度 压缩-由于产物的二级结构，多条条带走到一起-改变变性胶条件 4、测序自动化  3‘ GTAGCAACT 5’ ?d(ACG)TP+dTTP+ddTTP d(ACT)TP+dGTP+ddGTP d(AGT)TP+dCTP+ddCTP d (GCT)TP+dATP+ddATP T组 G组 C组 A组3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT5 CAddT* 5 CATCddG* 5 CATddC* 5 CddA* CATCGddT* CATCGTTddG* ddC* CATCGTTGddA* CATCGTddT* DNA测序中作链终止剂的核苷类似物 2‘, 3’-双脱氧核糖核苷5‘-三磷酸 复习提纲 1、加减法DNA测序的原理及其实例。 2、特异化学试剂裂解法进行DNA测序的原理和实例。 3、末端终止法进行DNA测序的原理和实例。 4、什么是停止与压缩反应？ 第二节 基因的化学合成及诱变 1955 Todd 二核苷一磷酸 磷酸二酯-磷酸三酯-亚磷酸三酯 液相-固相-自动化 1981 有活性tRNAAla-上海生化所-世界上第一个具有全部生物活性的人工核酸分子 一、化学合成法 1、保护基及其去除 核糖-OH、P、碱基的NH2 对保护基的要求：无付反应、稳定、易脱、脱保时链完整 2、缩合剂 磷酸酯键的形成（脱水反应、有机溶剂进行） 双环己基碳二亚胺 DCC 三甲基苯磺酰氯 MS 3、合成方法 （1）磷酸二酯法 付产物多、产率低、操作复杂 (2)磷酸三酯法:核苷间的磷酸基以三酯存在 付产物少、磷酸基被保护可用硅胶柱分离、产率高、反应时间短速度快 (3)亚磷酸三酯法 反应速度快、可固相合成 原理：*末端核苷（3’的第一个碱基）固定在高分子化合物上（聚苯乙烯纤维、硅胶、微孔玻璃珠） *循环反应 *洗涤除去未反应物和付产物、简化分纯、加快速度 4、合成寡核苷酸纯化方法 *脱盐：（乙醇沉淀、分子筛、反相柱C18）纯度低 *OPC柱纯化：（DMT）有短链、不适合基因合成和DNA序列分析、不宜纯化多于40mer的oligo *HPLC纯化：吸附于反相柱的差异、用于PCR反应；基因合成和DNA序列分析（较纯，40mer、Grich不适用、设备要求高） *PAGE纯化：可用于任何反应（