第四章目的基因的获取2009.pptVIP

第四章 目的基因的获取;;结构基因的组成;目的基因的获取方法;第一节 直接分离法;由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。;适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少,获得也比较简单.;二、随机片断化;1）4bp的内切酶;2. 机械切割法;三、物理化学法;目的基因的获取方法; 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。;（2）目前常用的载体 ;断点完全随机，片断长度合适于载体连接。;（2）载体与基因组DNA大片段的连接;各种酶的接头可以向公司定做或购买。;;4. 基因组文库的大小;;1. cDNA;（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。;分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 ;;反转录酶;用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。;剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。;④去掉发卡结构;;这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。;;;在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。;;6. cDNA文库的大小;7. cDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在;4、 cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。;8. cDNA文库与基因组文库相比的缺点;三、文库的查询（screening）;目的基因的获取方法;第三节 PCR扩增获得目的基因;;1. 直接从基因组中扩增;;（1）提取基因组 total RNA;;值得注意的是常规PCR，可以合成的DNA片段长度有限，一般在1KB以内，大于他扩增效果显著下降。;特殊类型的PCR;3、反向PCR;目的基因的获取方法;1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。;① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH;具体做法：将一个大的保护基团，如芳香磺酰氯（ArSO2Cl）或二环己基碳二亚胺（DCC）加到脱氧核苷酸的3`或5`羟基上。这样，具有5`-保护的单核苷酸，便能够通过它的5`-OP同另一个3`-保护的单核苷酸的3`-OH之间定向地形成一个二酯键，从而使它们缩合成两端都受保护的二核苷酸分子。;实验中使用的各种不同的保护基团，有些可以通过酸处理移去，有些可以通过碱处理移去。所以不论是5`-的保护基团还是3`-的保护基团，都可以通过酸或碱的脱保护作用而除掉。这样的一个带5`-保护的合成的二核苷酸分子，又能够同另一个带3`-保护的单核苷酸或二核苷酸进行第二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分子。;;原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。;;固相磷酸三酯合成过程;化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 ;T4 DNA连接酶;2. 互补延伸连接法;1. 直接合成基因;DNA合成仪;克隆外源基因