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三、用途 一、单链核酸酶（S1/ Bal31 Nuclease) 带切口的双链DNA DNA修饰酶 2.Bal31单链核酸酶的用途 2.1 DNA的缺失突变(Bal31) Bal31单链核酸酶具有单链核酸内切酶和双链DNA的3’、5’末端同时降解的活性。 5P P5 3HO OH3 末端转移酶 1.来源： 又称脱氧核苷酸转移酶，自牛胸腺中分离。  2.活性： 催化dNTP掺入DNA 3′-OH末端，形成同聚物末端；反应不需模板DNA，需Co2+。 ①ssDNA 3’-OH加尾 ②dsDNA 3’-OH加尾(包括平末端加尾) 5’ AACC-OH 5’ AACCTTTT 转移酶 Mg ++、dTTP 5’ AACC-OH 3’ TTGG 5’ AACCTTTT 3’ TTGG 转移酶 Co 、dTTP 3.用途: ①载体和DNA加上同聚“尾巴”以形成粘性末端 ②DNA 3’-OH端同位素标记 三、碱性磷酸酶与磷酸激酶 T4 DNA连接酶 碱性磷酸酶 内切酶 外源基因 磷酸激酶加磷酸基 P OH OH OH OH OH OH OH OH P P P Vector OH OH OH OH 牛小肠碱性磷酸酶（CIAP） Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal T4多聚核苷酸激酶 T4 Polynucleotide Kinase?? OH OH OH OH OH OH P P + OH OH P P 2Pi T4-DNA连接酶 外源DNA片段 自身无反应 缺口 缺口 T4-DNA连接酶 转化 修复 用碱性磷酸酶防止载体自身环化 碱性磷酸酶 磷酸激酶 * ，所以合成的DNA链长。故在DNA测序中很优越。 * Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的. * 核糖核酸酶H(RNaseH)催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的核内降解，产生不同链长带3羟基和5磷酸末端的寡核糖核酸。 * (锉磨工具酶)(特异性降解ssDNA或ssRNA * 只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。一般 生化与分子生物学技术和原理 欢 迎 学 习 本 课 程，请 多 提 宝 贵 意 见！ 主讲：蒋德明 实验B楼309 dmjiang@ 基因克隆与表达部分 供体细胞 载体分子 外源DNA 外源基因 分离 酶切 酶切 连接 转化 扩增 DNA重组分子 受体细胞 鉴定与表达 重组转化子 工程菌 或细胞蛋白产物 工程菌或细胞培养 重组产物分离纯化 基因克隆与表达 基因克隆的基本元件 PCR及文库克隆法 DNA重组及转化技术 转化子的筛选与鉴定 原核生物表达系统 一 基因工程的基本元件 ------工具酶 限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 逆转录酶 DNA修饰酶 第一节 限制性内切酶 定义:能够识别和切割双链DNA(dsDNA)分子内特异核苷酸 顺序的核酸内切酶,叫做限制性核酸内切酶. 主要特征 I型 II型 III型 切割位点 距寄主特异性位点至少数百bp的部位可能随机的切割 位于寄住特异性位点或两侧 距寄住特异性位点3’端24-26 bp处 序列特异的切割 不是 是 是 三种类型核酸内切酶特性差异 一、II型限制性内切酶切割类型 1、平齐末端（Blunt end） Hind II 切割反应 Sma I 切割反应 2.1 产生5’粘性末端 5’-G A-A-T-T-C-3’ 3’ C-T-T-A-A-G-5’ 5’-G-3’ 5’-A-A-T-T-C-3’3’-C-T-T-A-A-5’ 3’-G-5’ 2.2产生3’粘性末端 5’-C-T-G-C-A-G-3’ 3’-G A-C-G-T-C-5’ 5’-C-T-G-C-A-3’ 5’-G-3’ 3’-G-5’ 3’-A-C-G-T-C-5’ EcoRI ＋ ＋ PstI 2、粘性末端（Sticky end） 同尾酶 这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。 G-G-A-T-C-C C-C-T-A-G-G BamH I T-G-A-T-C-A A-C-T-A-G-T Bcl I A-G-A-T-C-T T-C-T-A-G-