临床检测--谷丙转氨酶活性的测定.pptVIP

血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（改良赖氏法） 1.掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的具体操作方法。 3.了解血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的临床意义。 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸： 【临床意义】 肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。 【思考题】 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？ 2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？ * * 三峡大学医学院生物化学教研室 临床指标的检测 【目的要求】 临床意义 谷丙转氨酶(Glutamic pyruvic Transaminase，GPT) 丙氨酸氨基转移酶(Alanine Transaminase，ALT) ALT(GPT)广泛存在于机体各种组织中，但在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是急性肝炎及肝细胞坏死，血清中谷丙转氨酶活性显著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此酶活性也可中度或轻度增高。 如何测定酶的活性? 活性单位定义中必须规定哪些条件? 在紫外分光光度计中，1ml血清(反应溶液总量为3ml)在340nm波长下，用内径为1.0cm的比色皿，在25℃，1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸氢酶催化下，使NADH+H+变成NAD+，使光密度下降0.001为1个转氨酶活性单位。 卡门氏单位的定义为： 丙氨酸 + α-酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸 GPT 乳酸氢酶 NAD+ +乳酸 NADH+H+ 丙氨酸 + α-酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸 GPT 乳酸氢酶 NAD+ +乳酸 NADH+H+ 改良赖氏法 显色反应 分光光度法 赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用卡门氏单位作表示的。 【实验原理】 200 150 97 57 28 0.00 相当于GPT活性(卡门氏单位) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4(ml) 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 ALT底物试剂(ml) 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 丙酮酸标准液(ml) 5 4 3 2 1 0 37℃水浴预温5分钟，各管加2,4-二硝基苯肼0.5ml混匀，再在37℃水浴中放置20分钟后，各管加0.4mol/L NaOH溶液5ml，混匀放置10分钟后，以蒸馏水调零点，用520nm波长比色，读取各管光密。. 各管的读数均减去对照管(O管)的光密度，然后以光密度值为纵坐标，各管相应的转氨酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。 实验操作 1. 标准曲线的制作: 5.0 5.0 0.4mol/L NaOH(ml) 0.1 — 血 清(ml) 混匀后，置37℃水浴中保温30分钟 0.5 0.5 2，4-二硝基苯肼液(ml) 混匀后，置37℃水浴中保温30分钟 0.5 0.5 ALT底物液(ml) — 0.1 血 清(ml) C T 2.酶活性测定：测定前将底物缓冲液在37℃水浴中预温5分钟，再按下表操作。 混匀，在室温中放置10分钟，以蒸馏水调零点，用520nm波长比色，读取光密度。用T-C管的光密度查标准曲线，即得到待测血清中所含ALT的酶活性。 参考值： 5~25卡门氏单位