第4章-载体的选择与构建学习资料.ppt

第四章 载体的选择与构建;主要内容;1.1 质粒的定义 ;1.2.2 按照构型： 环形双链DNA分子 共价闭合环状：两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型 开环DNA：一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口 线状DNA：这种质粒的双链断裂，由环状变为呈线状 这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时， 出现不同的迁移速率，超螺旋构型最快，其次是 线性构型，开环构型最慢。 线性质粒;1.2.4 按照宿主范围: 广宿主质粒（以及穿梭质粒） 单一宿主质粒 ;1.3 质粒的复制 ;1.3.2 拷贝数控制机理;RepA 调控;1.4 质粒的不稳定性;质粒上的par区段编码分配蛋白，质粒上还有par蛋白的结合序列（inc区）;质粒多聚体也导致分配不稳定： 质粒多聚体含有多个复制起点，其复制速度是单体的数倍，将导致大量细胞只含有多聚体质粒而影响分配稳定性; 用同一复制系统的两种质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在同一个细胞中不能和平共处。这种现象称之为不相容性;;（1）θ型复制 单向复制 双向复制 革兰氏阴性细菌中多数质粒是以θ型方式复制，R1，R100等是单向复制，F，R6k等是双向复制类型。;;质粒转移性：是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移。 质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能进行，即接合作用(conjugation)，这类质粒被称为自主转移质粒(self-transmissible plasmid)或接合质粒(conjugative plasmid)。;质粒; G-菌中质粒分子量较大，而G+菌中质粒较小； 已知大肠杆菌的F质粒、R1、R100、ColV、Collb-P9、 R6k、RP4等均属于自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒，其中较小的R6k质粒也有38kb。 G+细菌如链霉菌中的自主转移质粒，除SCPl是巨大质粒外，很多都是10kb左右的小质粒，而与转移有关的区域只有2kb左右。 自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同，G+细菌中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒分子量较小。;大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒自主转移过程中起着重要作用。 ;（2） 可移动质粒的特点 ;F质粒诱动ColEl转移的模型图 ;1.8 报告基因;蓝白斑筛选(?互补筛选）原理 ;X-gal;1.9 质粒的提取;（2） 碱裂解法（Birnboim and Doly，1979）;碱裂解法流程图;染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时（40-50s)，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。;1.10 质粒的改造;克隆片段一般插入Ap或Tc中，破坏一个抗性基因;pUC;;主要内容;2. 噬菌体和噬菌体载体; λ噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体是应用最为广泛的病毒载体。;;?噬菌体生活周期;当λ噬菌体侵入新的宿主细胞时，裂解和溶原途径以同样的方式开始。二者都需要前早期和后早期基因的表达。但是以后它们就分道扬镳了：如果晚期基因表达了，随之而来的是裂解发育；如果建立起阻遏蛋白cI的大量合成，接着发生的则是溶原化;后早期基因包括阻遏蛋白基因cI,两个复制基因(裂解侵染所必须)，和7 个重组基因(某些与裂解侵染时的重组有关，有两个是溶源时将λDNA 整合到细菌染色体中所必需)，还有3 个编码调控产物的基因，其调控产物有相反的功能： cⅡ和cⅢ这对调控产物是启动阻遏蛋白CI合成所必需的。（有利溶源） 调控蛋白Q 是一个使宿主RNA 聚合酶继续进入晚期基因的抗终止因子(有利裂解）;（4）cI在溶原化中的作用;只要阻遏蛋白cⅠ的含量充分，cⅠ基因就持续表达。结果是OL和OR无限期被占用，于是就阻遏了裂解周期，使原噬菌体维持其惰性形式。 阻遏蛋白的存在解释了超感染免疫性现象。如果有第二个λ噬菌体DNA 进入溶原细胞，由原噬菌体基因合成的cⅠ将立即与新噬菌体的OL和OR结合，阻止第二个噬菌体进入裂解周期。cI基因区段也称为免疫区，表示为imm?。 ;（5） CII和Cro的作用;它们之间的区别可归结为：究竟是阻遏蛋白CI还是Cro 将获得两个操纵基因的占用权。;int：整合酶基因， 识别宿主