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第五章 酶与细胞固定化 一、游离酶的缺点 1.酶的稳定性较差，在温度、pH、和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。 2.酶一般都是在水溶液中与底物反应，反应结束后酶难以回收。 3.反应结束后，酶成为产物的杂质。 二、概念 固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著特点。直接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体或固定化死细胞。 三、酶固定化的历史？ 第一节 酶的固定化 一、酶的固定化方法 1.吸附法 2.包埋法 包埋法 3.结合法 第二节 固定化酶的性质 二、固定化酶的性质 三、固定化酶的应用 第二节 微生物、植物和动物细胞固定化 一、概念 通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。固定化细胞能够进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称为固定化或细胞或固定化增殖细胞。 二、细胞固定化的方法 三、固定化微生物细胞的应用 四、固定化植物细胞 五、动物细胞固定化 六、原生质体固定化 六、原生质体固定化 对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。 3 4 5 6 7 游离酶： 固定化酶： 底物特异性 对热的稳定性提高 保持稳定性好 对酶的抵抗性增强 对变性剂的耐受性提高 载体性质对最适pH的影响 产物性质对最适pH的影响 最适pH 最适温度 稳定性 1.固定化酶的优点 1.酶的稳定性增强，可以长期保存。 2.可以反复使用或连续使用很长时间。 3.易于产物分离，有利于产物纯化。 2.固定化酶的应用 1.在工业生产中的应用 2.在酶传感器方面的应用。 氨基酸酰化酶——DL-氨基酸拆分 葡萄糖异构酶——果葡糖浆生产 天冬氨酸酶——天冬氨酸生产…… Pt电极（—） Ag电极（+） O2 G O2 H2O2 G酸 高分子膜 利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。 （一）吸附法 pH3~5 - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + 载体：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、金属丝网、微载体、中空纤维…… 凝胶包埋法 半透膜包埋法 （二）包埋法 将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方称为包埋法。 载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺…… （一）利用固定化微生物生产各种产物 酒类 氨基酸 有机酸 酶和辅酶 抗生素 甾体转化、废水处理 有机溶剂、维生素、化工产品的生产 （二）制造微生物传感器 微生物传感器是由固定化微生物细胞与各种能量转换器（电极、燃料电池、场效应管等）密切结合而成的传感装置。 呼吸活性测定型：利用固定在高分子膜上的微生物细胞的呼吸作用，测定氧气的消耗和二氧化碳的生成，从而确定被测定物质的量。 O2电极 O2↓CO2↑ 高分子膜 电极活性测定型：利用固定在膜上的微生物细胞的新陈代谢作用，测定电极活性物质的量的变化，从而确定样品中欲测物质的含量。 离子选择电极/气体电极/生物燃料电池 H+ 高分子膜 葡萄糖、有机酸、醇、抗生素、氨基酸、氨、硝酸盐、生化需氧量、细胞数量等的测定。 （三）微生物传感器的应用 （一）固定化植物细胞的特点 1.提高存活率 2.防止聚集成团 3.便于更换培养基 4.可反复使用 5.利于产品的分离纯化 （二）方法 吸附法、包埋法 * * 固定原生质体生产谷氨酸 日本 1982年 固定化植物细胞：长春花和毛地黄细胞 1979年 固定大肠杆菌生产天冬氨酸 日本 1973年 固定化酶：Immobilized Enzyme 第一届国际酶工程大会 1971年 固定化氨基酰化酶，DL-氨基酸拆分 千火田一郎 1969年 以聚氨基苯乙烯固定羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶 Grubhofer,Schleith 1953年 交联法 胶体包埋法 半透膜包埋法 离子键结合法 共价键结合法 热处理法 结合法 包埋法 吸附法 吸附法是利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法。 活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石。 优点：操作简单、条件温和、 载体廉价易得、可反复使用。 缺点：结合力不劳、容易脱落。 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺…… （1）凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法。 （2）半透膜包埋法 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶. 制备方法： 酶， 水， 乙二胺 癸