第17章液相色谱法.pptVIP

第十七章高效液相色谱法 17-1 概述 高效液相色谱法的特点： 高压、高效、高速、高灵敏度。适用于高沸点、热不稳定及生化试样的分析。 17-2 高效液相色谱仪 一、流程及主要部件 1.流程 高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 还配有辅助装置： 梯度淋洗 自动进样 数据处理等 2.主要部件 (1)高压输液泵 ①压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的 固定相（10μm，常用3~5μm）， 液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高 效液相色谱的特点之一。 ②应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可 调、耐腐蚀等特性。 （2）梯度淋洗装置 HPLC有等梯度洗脱和梯度洗脱两种。 前者保持流动相组成、配比恒定。 后者采用两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按照程序连续改变流动相的浓度配比及极性。 梯度淋洗的作用： 提高分离度 缩短分析时间 提高分析精度 ②外梯度— 低压梯度装置 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例混合后，再用一台高压泵输入色谱柱中。（先混合后加压） (4) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减 小填料粒度和柱径以提高柱效。 (5) 高效液相色谱检测器 ①紫外光度检测器（UV） 最常用的检测器，可用于梯度洗脱。如固定波长型的汞灯254nm或280nm的紫外检测器、可调波长的氘灯或氢灯(200-400nm)。不锈钢池＜10μL。对UV无吸收的组分不响应；对UV吸收较大，如苯不可作流动相。 ②光电二极管阵列检测器（DAD） 为新型的紫外吸收检测器。以氘灯为光源，绘制出随时间变化的光谱吸收曲线（A～λ）计算机快速处理，可获得分离组分的三维彩色谱图，得到更多信息。 17-3 高效液相色谱法的类型 1.流速 ①流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直线。 ②降低流速，柱效提高不是很大。 ③但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。 2.固定相及分离柱 ①气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 ②选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 ③选择短柱、细内径提高分析速度。研制高效柱填料是一活跃领域。 3.流动相及流动相的极性 ①可显著改变组分分离状况的流动相选 择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为： 淋洗液，洗脱剂。 ②亲水性固定液常采用疏水性流动相， 即流动相的极性小于固定相的极性， 称为正相液液色谱法， 极性柱也称正相柱。 ——适合极性化合物分离。 ③若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。 ——适合非极性化合物分离。 4.流动相组成 ①流动相按组成不同：分为单组分和多组分。 ②按极性不同：分为极性、弱极性、非极性。 ③按使用方式不同： 分为固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 5.选择流动相时应注意的几个问题 ①尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 ②避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子 ③试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 ④流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 化学键合固定相类型： 化学键合固定相是目前应用最广、性能最佳的固定相。 （1）硅氧碳键型： ≡Si—O—C （2）硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐 有机溶剂，应用最广。 （3）硅碳键型： ≡Si—C （4）硅氮键型： ≡Si—N 4.离子交换色谱（IEC） 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。 5.凝胶色谱（空间排阻色谱）SEC （1）以凝胶为固定相。 （2）凝胶是一种经过交联的、具有立体网 状结构和不同孔径的多聚