凋亡研究进展及凋亡检测04.pptVIP

细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术 赵万洲 博士 南京凯基生物科技发展有限公司 2009.4.21 细胞凋亡（apoptosis） 概念：程序化细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。 细胞凋亡的信号转导通路 死亡受体信号通路 线粒体信号通路 内质网和高尔基体的信号通路 细胞凋亡的基因调控 细胞凋亡诱导剂 化学诱导剂 H2O2 化疗药物 物理性因子 放射线 UV 生物因子 Anti-Fas TNF Trail 细胞凋亡的形态学变化 细胞凋亡的形态学检测方法 光学显微镜 荧光显微镜 (Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI ) 电子显微镜 光学显微镜观察 荧光显微镜观察 电子显微镜观察 细胞凋亡的生物化学检测方法 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） TUNEL法 DNA片断化检测 DNA Ladder 测定 DNA含量分析 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 流式细胞仪分析（FACS） TUNEL法 检测原理： Tunel 原位凋亡检测试剂盒 检测方法 DNA片断化检测 DNA Ladder DNA含量分析碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰（sub-G1）即细胞凋亡群 细胞凋亡的分子水平检测方法 Caspase分子的检测 线粒体膜势能的检测 JC-1 凋亡相关分子的检测 促凋亡分子 抑凋亡分子 相关信号通路分子的检测 Caspase分子的检测 Caspase3、8和9，2，6等 Caspase检测方法 分光光度法检测 FACS检测 Western Blot检测 全长检测 剪切体检测 Caspase 3 Western Blot检测 线粒体膜势能的检测(JC-1) 凋亡相关分子的检测 促凋亡分子 Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid, AIF,Apaf-1和cytochrome c等 抑制凋亡分子 Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等 端粒酶活性检测试剂盒 氧化应激系列检测 相关信号通路分子的检测 抗凋亡信号通路 PI3K-Akt pathway NIK-NF-kB pathway 促凋亡信号通路 MKK-JNK pathway Fas-FADD pathway P53 pathway 综合解决方案 Thank You! Zwzj@ 凋亡分析总体原则 凋亡分析总体原则： 1）因为凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进行多指标同时检测； 2)由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确性； 3）实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性。 凋亡或坏死？ 死亡受体通路或线粒体通路？ 具体的调控分子机制 { Annexin V Tunel DNA content { Caspase 3, 8, 9 JC-1 stain { Bax/Bcl-2 Cytochrome C JNK pathway ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 不同凋亡阶段的区分 流式细胞仪定量分析细胞凋亡 荧光显微镜定性观察细胞凋亡 TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。 凋亡产生的断裂的DNA-----TdT酶标记dUTP-Biotin-----结合链霉亲和素-HRP-----作用于底物DAB显色 石蜡包埋组织切片 冰冻组织切片 固 定 脱 蜡 水 合