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生物学教学综合实验 ——绪论 碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定 鸡胚生长发育 植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化及其分离纯化参数测定 1.缓冲液 A pH 8.5 1000mL/组 50mmol/L Tris-HCl 0.2mmol/L NaCl 0.5mmol/L EDTA 2. 缓冲液 B pH 8.5 500mL/组 50mmol/L Tris-HCl 2mmol/L MgAc2 1mmol/L EDTA 3. 缓冲液 C 缓冲液 A + 50% 甘油 1000mL 4. 测活液： 50mM Tris-HCl pH8.5 200mL 0.2mg/mL BSA 10 mmol/L pNPP 2mmol/L MgAc2 5. 终止液：0.5mol/L Na3PO4 1000mL/组 6. 0.5mol/L NaOH 500mL 7. 标准蛋白质溶液（1mg/mL BSA）：10 mg BSA用缓冲液 A溶解，10mL容量瓶定容。 8. 酶稀释液 100mL 50mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.2mg/mL BSA 9. 考马斯亮蓝试剂2000mL: 考马斯亮蓝G250 200mg溶于100mL95%乙醇中，加入200mL磷酸，用蒸馏水稀释至2000mL，滤纸过滤（最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G250，7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸）。或考马斯亮蓝G250 200mg溶于100mL95%乙醇中，加入200mL磷酸混匀，配成原液。临用前取原液15 mL加蒸馏水稀释至100mL，滤纸过滤。 10. 1mol/L Tris-HCl（pH 7.4） 100mL 12.1g Tris溶于80mL超纯水，待Tris完全溶解温度降低至室温，用浓HCl调节pH至7.4（约7mL浓HCl），定容到100mL，高压灭菌，4℃保存 11. LB培养基 100mL 胰蛋白胨 1.0g；酵母提取物0.5g；NaCl 1.0g 加入200μL 5mol/L NaOH调节pH至7.0~7.4，加入去离子水至总体积100mL，121℃高压灭菌20分钟 12. TM表达培养基 100mL （200mL） 胰蛋白胨 1.2g；酵母提取物 2.4g；NaCl 1.0g；50%甘油 1.2mL 加入1mol/L Tris 0.93mL调pH至7.4，加入去离子水至总体积100mL，121℃高压灭菌20分钟 13. 50mg/mL 羧苄青霉素（Carb） 用灭菌水配制，无菌滤器过滤，-20℃冰箱保存 14. 200mg/mL IPTG 取2g IPTG溶于8mL去离子水，用水补至10mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1mL，保存于-20℃冰箱 15. 0.3mol/L NaCl 200mL/组 碱性磷酸酶基因表达 预培养：接一单菌落到3mL含Amp的LB培养基中，370C、190rpm 振荡培养过夜； 取 2mL菌液转移到200mL含Amp的TM液体培养基的锥形瓶中，370C、250rpm振荡培养3小时，至OD600 0.7-0.8，加入IPTG（40ug/mL）； 250C、160rpm继续振荡培养16小时； 离心 6000rpm，40C，10min，菌体沉淀在-200C冻存。 Sephacryl-S200 HR分子筛层析柱的准备 装柱：Sephacryl-S200 HR介质悬液100mL连续装入1.0×60 cm的层析柱中。 先用10mL 0.5mol/L NaOH流洗柱子，再用200mL缓冲液A平衡好柱子备用，流速为15mL/h。 阴离子交换DEAE-FF柱的准备 表达菌体细胞的破碎 加入30 mL BufferB，重悬菌体 超声破碎：输出功率1200W，超声2秒，间隔10秒，超声40次 12,000rpm 4℃离心20min 取上清200 uL加入200 uL 甘油，混匀（Ⅰ号样品），-20℃保存备用 DEAE-FF离子交换层析 硫酸铵沉淀 Sephacyl S-200 HR分子筛层析 将上述离心上清上样、洗脱（Buffer A），洗脱流速为 15 mL/小时，每管接收2 mL。合并光吸收高峰管，并用Buffer C 对其透析浓缩 4小时，分装-20℃保存备用(IV号样品)。 分子筛层析柱再生：用10mL0.5M NaOH洗涤柱子，再用50 mL20％乙醇洗涤，4℃保存。 阴离子交换DEAE-FF柱： 待样品洗净后，先用20mL 0.5mol/L NaOH流洗柱子，再用200mL蒸馏水洗